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Y. Niu, Y. Yu, X. Shi, F. Fu, H. Yang, Q. Mu, et al. In Situ Measurement of Nanoparticle–Blood Protein Adsorption and Its Heterogeneity with Single-Nanoparticle Resolution via Dual Fluorescence Quantification， Nano Letters 2024 Vol. 24 Issue 30 Pages 9202-9211， DOI: 10.1021/acs.nanolett.4c01469

摘要：蛋白冠的形成賦予納米藥物獨特的生物學特性，深刻影響它們在體內的命運。非特異性納米顆粒-蛋白質相互作用通常是高度異質的，這可能導致仍未被充分探索的單個納米顆粒的獨特生物行為和體內命運。為了解決這個問題，我們建立了一種原位方法，可以在單個納米顆粒水平上定量檢查納米顆粒-蛋白質吸附。該方法集成了雙重熒光定量技術，其中首先通過納流式細胞術單獨分析納米顆粒，以檢測來自吸附蛋白質的熒光信號。然后通過使用酶標儀定量校準將獲得的熒光強度轉化為蛋白質數量。因此，這種方法能夠分析納米-蛋白質相互作用的顆粒間異質性，以及原位監(jiān)測血清中蛋白質吸附動力學和納米顆粒聚集狀態(tài)，為全面了解納米-生物相互作用進行預處理，并預測納米藥物的體內命運。

      一旦納米顆粒 （NP） 進入血液，蛋白質就會自發(fā)吸附到其表面，形成蛋白冠，賦予它們新的生物身份。揭示 NP-蛋白質相互作用對于預測納米藥物的體內命運和促進其臨床轉化至關重要。目前的 PC 分析方法主要依賴于從周圍培養(yǎng)基中預分離 NP-PC 復合物，導致直接與生物界面相互作用的松散結合的外層蛋白（軟電暈）的損失。盡管在原位表征方面投入了大量精力，例如動態(tài)光散射、熒光相關光譜法和 DOSY 19F-NMR用于研究 NP 尺寸演變，圓二色光譜法用于蛋白質結構變化，以及等溫滴定量熱法對于蛋白質吸附熱力學，這些方法僅提供基于納米顆粒群平均值的數據。NP 的異質性及其不同的蛋白質吸附譜導致單個 NP 之間不同的體內命運，但仍未得到充分探索。

       實現(xiàn) NP 的單顆粒分析是解決 NP-蛋白質相互作用異質性的前提條件。已采用掃描和透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、超分辨率熒光顯微鏡、 和多色受激發(fā)射損耗顯微鏡；但是，高 通量分析是一個限制。最近的進展包括 3D 實時單粒子跟蹤光譜，它可以“鎖定”單個自由擴散的聚苯乙烯 NP 以探測其蛋白質電暈。通過分析追蹤 NP 的熒光信號和擴散運動，研究人員使用均方位移分析量化了“硬日冕”。另一種創(chuàng)新方法是散射顯微鏡支持的實時全光學納米顆粒分析，它可以在單顆粒水平上跟蹤全血清中蛋白質電暈的形成，而無需標記。該方法允許實時原位跟蹤金屬和介電納米顆粒上的吸附蛋白質質量、親和力和動力學。使用磁懸浮檢查了蛋白冠的異質性，這表明將 NP 暴露于人血漿會導致高度異質的蛋白冠組成。該技術還能夠在幾個小時內提取均勻包被的 NP 以及監(jiān)測 NP 表面的 PC 演變。采用PuriMag公司的生物磁珠研究蛋白冠（http://www.5000js.com/Product/8096211554.html）具有現(xiàn)實的意義。

       流式細胞術是一種高通量單顆粒檢測技術，可對懸浮液中的細胞大小顆粒進行定量分析。由于其靈敏度限制，傳統(tǒng)流式細胞儀只能檢測具有強熒光的大顆粒 （>500 nm）（>200 個熒光分子）。 流式細胞術已應用于通過吸附蛋白電暈的免疫標記來研究 NP-蛋白質相互作用，從而可以檢測用于生物識別的表面分子基序（例如，ApoB-100 和 IgG 表位），例如細胞受體。然而，由于檢測靈敏度有限，流式細胞儀只能測量納米顆粒群，無法提供單個 NP 水平的信息。因此，無法區(qū)分單個 NP 之間蛋白質相互作用的異質性。

       在這項研究中，我們建立了一種基于納流式細胞術 （NanoFCM） 的方法，該方法能夠在單納米顆粒水平上對 NP-蛋白質相互作用和單個 NP 之間的異質性進行原位定量探測（方案 1）。NanoFCM 將光散射與單分子熒光檢測集成在一個鞘狀流中，能夠以高達每分鐘 10,000 個顆粒的通量檢測小至 24 nm 的二氧化硅和 7 nm 的金納米顆粒的單個 NP。此外，NanoFCM 的熒光檢測限低至每個顆粒 3 個 Alexa fluor 555 熒光分子。使用這種技術，我們監(jiān)測了在蛋白質溶液中孵育后氨基功能化聚苯乙烯 NPs （PS-NH2 NPs） 的尺寸演變和聚集狀態(tài)。通過熒光標記蛋白質，我們直接定量了人血清白蛋白 （HSA） 和雙蛋白 （HSA 和轉鐵蛋白，Tf） 在 NP 表面的吸附，并分析了單個 NPs 之間蛋白質吸附的異質性。此外，無需分離即可直接監(jiān)測人血清中的蛋白質吸附動力學。

方案 1

方案 1.蛋白冠對納米顆粒的形成和生物效應示意圖 （a） 以及使用 NanoFCM 以單納米顆粒分辨率檢測納米顆粒-血液蛋白質相互作用的原位表征技術 （b）

將人血清或 HSA 溶液與 NP 一起孵育，以模擬血液中的蛋白質環(huán)境。所得混合物由新形成的 NP-PC 復合物組成，直接進行 NanoFCM 分析，無需將它們與游離（非吸附）蛋白質和 NP 分離。NanoFCM，也稱為單分子流式細胞術，通過將光散射與單分子熒光檢測相結合，實現(xiàn) NP 的單獨分析。NP 線性對準以通過由高速鞘流實現(xiàn)的激光束，這可以將樣品流流體動力學聚焦成非常細的流 （～1.4 μm）。當每個 NP 穿過聚焦激光束的中心區(qū)域時，它會在側向散射 （SS） 和熒光 （FL） 檢測通道上產生一束光電流。為每個事件記錄爆發(fā)區(qū)域，表示檢測到的光子的積分數。（31） 據我們所知，NanoFCM 迄今為止尚未用于研究蛋白質與 NP 的相互作用。關于 NP-PC 系統(tǒng)，SS 信號的變化表明由于蛋白質吸附導致 NP 大小的變化，而 FL 信號表明熒光標記的蛋白質與單個 NP 的結合。 通過使用一系列不同直徑的單分散標準 NPs 來校準 NPs 的 SS 強度，并采用熒光分析來校準吸附蛋白的 FL 強度。

圖 2.使用 NanoFCM 原位檢測 NP 蛋白吸附。（a） 說明 HSA 的結構、3D 尺寸和熒光標記的方案（蛋白質數據庫 （PDB） 登錄碼 1AO6）。（b） 與不同濃度的 HSA-FITC（0 mg mL–1、0.5 mg mL–1、2 mg mL–1 和 5 mg mL–1）孵育 1 h 前后 NPs 的 SS 分析，包括 SS 突發(fā)跡線、SS 強度分布直方圖和大小分布直方圖。尺寸分布來自圖 S3a 中描述的標準曲線。（c） 與不同濃度的 HSA-FITC （0 mg –1、0.5 mg –1、2 mg –1 和 5 mg –1） 孵育 1 h 前后 NPs 的 FL 分析，包括 FL 突發(fā)軌跡、二變量點圖和 FL 強度分布直方圖。

       將 NP 與濃度為 0 mg mL–1、0.5 mg mL–1、2 mg mL–1 和 5 mg mL–1 的 HSA-FITC 溶液一起孵育，在 NP 周圍形成蛋白質電暈。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）（圖 S5）和 TEM（圖 S6）均證實 NP 上存在吸附的 HSA。含有 NP-PC 復合物和游離蛋白質的樣品直接進行 NanoFCM 分析，同時進行 DLS 測量作為比較。圖 2b 顯示了不同濃度 HSA 下 NP 的 SS 突發(fā)跡線、SS 強度分布和尺寸分布。SS 突發(fā)軌跡揭示了可檢測到的側向散射光信號。NP-PC 復合物的 SS 強度和尺寸分布表現(xiàn)出最初的展寬，然后隨著 HSA 濃度的增加而變窄。當 HSA 濃度為 0.5 mg mL–1 時，NP-PC 復合物的中位粒徑達到 ～254 nm，是純 NP 的兩倍 （～ 135 nm）（圖 2b）。在這種低 HSA 濃度下觀察到的 NP 聚集歸因于 HSA 中和 NP 的正電荷，（36） 這將在后續(xù)部分中探討。將 HSA 濃度進一步增加到 2 mg mL–1 和 5 mg mL–1 后，NP-PC 復合物的中位粒徑恢復為與原始 NP 的粒徑相同（圖 2b）。這種現(xiàn)象是由于蛋白質吸附逐漸增加，導致 NPs 上的表面負電荷增加（HSA 的等電點 ～ 4.7）。（37） 因此，靜電排斥占主導地位并使 NPs 膠體穩(wěn)定。DLS 研究證實了類似的發(fā)現(xiàn)，如圖 S7 所示。這些結果強調了 NanoFCM 在原位檢測中的有效性，能夠預測由血液蛋白質吸附引起的體內 NP 聚集。

圖 3.單納米顆粒水平上蛋白質對 NP 的吸附表征。（A-E）與不同濃度的 HSA-FITC（0 mg mL–1、0.5 mg mL–1、2 mg mL–1、5 mg mL–1 和 50 mg mL–1）孵育時，NP-蛋白復合物的 SS 信號與 FL 信號的雙變量點圖。（f） 使用 DLS 和 NanoFCM 測量的 NP-蛋白質復合物的直徑。（g） 使用 Malvern Zetasizer 測量的 NP-蛋白質復合物的 ζ 電位。（h） 計算出的每 NP 吸附的 HSA 數量，其中 α 表示通過將 HSA 分子視為直徑 （d） = 7.5 nm 和橫截面積 （σ） = πr2 = 44.18 nm2 的剛性球體，表示理論單層飽和吸附。（i） NPs 與不同濃度的 HSA-FITC 孵育時熒光的變異系數 （CV）。

       使用 NanoFCM 獲得的結果通過 DLS 研究得到驗證，如圖 3f 所示。由于吸附蛋白質的負電荷，NP 的ζ電位在 HSA 孵育后經歷了從正到負的轉變（圖 3g）。在 0.5 mg mL–1 HSA 孵育時，蛋白質吸附相對較低，表面幾乎呈中性。在這種情況下，DLS 檢測到的平均粒徑約為 300 nm，與原始 NP 相比增加了約 100 nm。這種現(xiàn)象可能是由于范德華短程吸引力優(yōu)于庫侖靜電排斥，導致輕微的 NP 聚集。隨著 HSA 濃度的增加，蛋白質吸附逐漸增強，導致 NPs 的表面負性升高。隨著靜電排斥的優(yōu)先，NP 變得更加穩(wěn)定，它們的大小逐漸接近原始 NP 的大?。▓D 3f，g）。

圖 4.使用 NanoFCM 在雙蛋白質系統(tǒng)中進行蛋白質吸附分析。（a） 模型雙蛋白系統(tǒng) （HSA-FITC 和 Tf-Cy5） 中蛋白質吸附的示意圖。（b） SS 信號與代表 HSA 的綠色 FL 信號的雙變量點圖 PS@HSA/Tf 。（c） SS 信號與代表 Tf-Cy5 的紅色 FL 信號的雙變量點圖 PS@HSA/Tf 。（d） 紅色 FL 信號與 PS@HSA/Tf 的綠色 FL 信號的雙變量點圖 （e） 每個 NP 吸附的 HSA 和 Tf 平均值的定量分析。（f） 反映 HSA 和 Tf 在復雜系統(tǒng)中吸附異質性的相應 CV 值。

       為了證明該技術檢測較小納米顆粒的適用性，合成了通過 TEM 測定的直徑為 ～50 nm 的二氧化硅納米顆粒 （SiO2 NPs），并使用 NanoFCM 進行了測量。結果顯示粒徑分布范圍為 50 至 100 nm，中位粒徑為 ～60 nm。與 HSA 孵育后，NP 直徑增加到 ～70 nm（圖 S11a，b）。從 SS 信號與 FL 信號的雙變量點圖中，我們可以清楚地看到由于蛋白質吸附，單個 NP 上的熒光增加（圖 S11c-e）。

       Vroman 效應是蛋白質電暈研究中的關鍵現(xiàn)象，它描述了蛋白質在 NP 表面上的動態(tài)吸附，展示了隨著時間的推移，最初吸附的蛋白質被其他具有較高親和力的蛋白質競爭性取代。了解這種效應對于解開蛋白質電暈形成的復雜性及其影響至關重要，因為它控制著蛋白質電暈的進化組成和生物相互作用，從而影響 NP 在生物系統(tǒng)中的命運。然而，實現(xiàn)蛋白質電暈組成的實時分析仍然是一個關鍵挑戰(zhàn)。在這里，我們?yōu)榈鞍踪|吸附動力學的原位和定量監(jiān)測做出了貢獻。雖然這并不能闡明特定的蛋白質交換行為，但它有助于理解 Vroman 效應。

       將 NPs 與人血清 （HS） 孵育，并使用 NanoFCM 研究蛋白質吸附動力學。在圖 5a 中，示意圖橫截面說明了蛋白質電暈形成的三個代表性階段：吸附和締合階段、硬電暈 （HC） 形成階段和軟電暈 （SC） 形成階段。圖 5b 顯示了與血清孵育后 NP 的熒光信號的時間依賴性右移，圖 5c 中相應的 FL 爆發(fā)高度分布直方圖證實了這一趨勢，共同表明蛋白質吸附到 NP 上。平均熒光強度 （MFI） 值揭示了 PC 的快速形成，因為近一半的電暈蛋白在 1 分鐘內被吸附（圖 5d）。蛋白質吸附在 30 分鐘內達到約 90%，這一過程與 HC 形成階段一致。孵育時間延長至 24 小時后，僅觀察到熒光的微微增加，表明在 SC 形成階段存在持續(xù)但適度的蛋白質結合。

圖 5.監(jiān)測 NP-蛋白質相互作用進化過程中吸附蛋白質的數量變化。（a） 人血清中蛋白質吸附對 NPs 的演變示意圖。HC 以紅色圓圈突出顯示，而 SC 以藍色圓圈區(qū)分。（b） 在 0 至 24 小時期間形成的 NP-PC 復合物的 SS 爆發(fā)高度與 FL 爆發(fā)高度的雙變量點圖。（c） NP-PC 復合物在不同時間的 FL 爆發(fā)面積直方圖。（d） NP-PC 復合物在不同時間間隔的平均熒光強度。（e） 血清孵育期間不同時間點 NP-蛋白復合物熒光的變異系數 （CV）。

       圖 5c，e 說明了異質性隨孵育時間的演變。在圖 5c 中，NP-PC 復合物的 MFI 分布在孵育 10 分鐘后顯示急劇增加，表明 NP-蛋白質復合物的異質性增強。圖 5e 中所示的 CV 值進一步證明了這種異質性的增加。與單蛋白和雙蛋白系統(tǒng)中的 CV 值相比，在血清蛋白吸附中觀察到的 CV 值較大（圖 3i 和 4f），表明血清中存在更復雜和多樣的納米生物相互作用，這可能導致單個 NP 之間由于蛋白質涂層的不同而具有不同的體內命運。

      總之，我們開發(fā)了一種原位方法，用于在單個納米顆粒水平上定量分析納米顆粒-蛋白質相互作用。通過利用散射光進行納米粒徑演變和利用熒光信號量化蛋白質吸附，我們確定了蛋白質濃度與納米顆粒聚集之間的相關性。值得注意的是，低濃度和高濃度誘導聚集，而中等濃度通過帶負電荷的蛋白質的靜電排斥保持膠體穩(wěn)定性。此外，定量蛋白質吸附揭示了蛋白質單層，每個顆粒包含 ～600 個 HSA 分子。該方法允許對血清中的納米顆粒聚集狀態(tài)和蛋白質吸附動力學進行原位定量監(jiān)測，因此有望在體內實驗之前對納米藥物的穩(wěn)定性和性能進行預評估。

蛋白冠研究專用磁珠納米粒http://www.5000js.com/Product/8096211554.html