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      不同平臺(tái)來(lái)源數(shù)據(jù)的交互驗(yàn)證是經(jīng)典的驗(yàn)證方法之一。2023年發(fā)表在《Nature》期刊上的研究利用Olink Explore 3072和Somascan v4平臺(tái)，結(jié)合2023年4月發(fā)表的最新人類(lèi)血漿蛋白質(zhì)組圖譜，研究了基于親和力的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果與相應(yīng)基因組數(shù)據(jù)之間的一致性。該研究表明785種蛋白質(zhì)同時(shí)具有基于親和力與質(zhì)譜的支持性證據(jù)，而質(zhì)譜能提供獨(dú)立于基于親和力的平臺(tái)的血漿蛋白發(fā)現(xiàn)機(jī)會(huì)，這些蛋白常為更低豐度的蛋白。

2. MS-Based Platforms to Profile the Circulating Proteome
    基于 MS 的平臺(tái)，用于分析循環(huán)蛋白質(zhì)組

近年來(lái)，基于質(zhì)譜的血漿蛋白質(zhì)組技術(shù)在以下幾點(diǎn)取得了較大進(jìn)展：

• 納米磁珠富集：基于納米生物界面上蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理設(shè)計(jì)的能夠適配自動(dòng)化工作流程的超順磁性功能化納米顆粒（NPs）已被用于壓縮血漿蛋白極大的動(dòng)態(tài)范圍，實(shí)現(xiàn)了數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)數(shù)千種血漿蛋白質(zhì)的檢測(cè)，有望擴(kuò)展到千例級(jí)別的大隊(duì)列。與基于抗體的富集策略不同，基于納米顆粒的富集策略可無(wú)偏性檢測(cè)整個(gè)蛋白質(zhì)組，這種策略將成為血漿蛋白質(zhì)組研究的未來(lái)趨勢(shì)。在普睿邁格的血液蛋白冠磁珠（http://www.5000js.com/Product/8096211554.html）的推動(dòng)下，基于納米顆粒富集策略的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)可覆蓋多達(dá)5000種以上的血漿蛋白。

• 自動(dòng)化樣品制備：移液工作站的普及為蛋白質(zhì)組樣品制備的自動(dòng)化做出了卓越貢獻(xiàn)。相比繁瑣的手工操作，自動(dòng)化樣本制備平臺(tái)提高了蛋白質(zhì)組學(xué)樣本前處理的通量，促進(jìn)了ISO13485醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施與受監(jiān)管的臨床實(shí)驗(yàn)室中蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開(kāi)展。

• 液相色譜：新型液相色譜系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)采用了新的分析流速（如高流和微流）和更短的梯度，與更靈敏的質(zhì)譜儀結(jié)合，使得每天能夠檢測(cè)超過(guò)100個(gè)樣品。

• 質(zhì)譜靈敏度：2023年Orbitrap Astral質(zhì)譜儀的問(wèn)世使得質(zhì)譜的靈敏度產(chǎn)生了極大的飛躍，能夠?qū)崿F(xiàn)超過(guò)1000種血漿蛋白的檢出，與額外的富集方法結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)超過(guò)4000種血漿蛋白的檢出。

• 質(zhì)譜穩(wěn)健性：過(guò)去幾年，針對(duì)大隊(duì)列樣本設(shè)計(jì)的timsTOF HT質(zhì)譜儀在幾項(xiàng)大規(guī)模血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究中展示了其耐久性、穩(wěn)健性和持續(xù)高性能的特點(diǎn)，為未來(lái)的大隊(duì)列血漿蛋白質(zhì)組研究趨勢(shì)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

• 數(shù)據(jù)采集：數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）已被證明能夠在樣品中持續(xù)覆蓋大量蛋白質(zhì)的定量，在眾多研究中得到了應(yīng)用。

       以上方法提高了血漿蛋白質(zhì)組檢測(cè)的樣本吞吐量、檢測(cè)穩(wěn)定性與定量準(zhǔn)確性，并降低了成本。更大的樣本量不僅增加了統(tǒng)計(jì)學(xué)效力以有效應(yīng)對(duì)臨床樣本的變異性，還允許了機(jī)器學(xué)習(xí)方法在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中的應(yīng)用。

3. Future of Targeted MS-Based Proteomics
    基于 MS 的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的未來(lái)

2023 Build of the Human Plasma Proteome PeptideAtlas
2023 構(gòu)建人血漿蛋白質(zhì)組肽圖譜

       自2005年以來(lái)，HPPP一直致力于建立血漿可檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的穩(wěn)定驗(yàn)證。截至2023年4月，人類(lèi)血漿蛋白質(zhì)組圖譜覆蓋了113個(gè)數(shù)據(jù)集，較2021年7月增加63%，收錄肽段數(shù)達(dá)到了26萬(wàn)個(gè)，增加27%，擁有至少2個(gè)≥9個(gè)氨基酸的非嵌套唯一映射肽的典型蛋白數(shù)達(dá)到了4608個(gè)，增加213個(gè)，共占人類(lèi)蛋白質(zhì)組的23%。

       此外，從血液中提取的細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組圖譜于2021年首次推出，2023年4月構(gòu)建的人類(lèi)細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組圖譜在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了擴(kuò)展，覆蓋了4985個(gè)典型蛋白，僅比人類(lèi)血漿蛋白質(zhì)組圖譜多377個(gè)，顯示了細(xì)胞外囊泡蛋白與血漿蛋白的高度重疊性與良好的豐度相關(guān)性。這提示血漿樣本能覆蓋大量的細(xì)胞外囊泡來(lái)源信息，助力對(duì)疾病機(jī)制的深入解析。

血漿/血清樣本與細(xì)胞外囊泡樣本中蛋白質(zhì)豐度的比較

細(xì)胞外囊泡（EV）指各類(lèi)活細(xì)胞向細(xì)胞外釋放的納米級(jí)脂質(zhì)雙分子層囊泡，以下特點(diǎn)使其作為生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)象與藥物遞送的載具具有極高的研究意義：

• 攜帶血液中難以檢測(cè)到的蛋白質(zhì)，如疏水蛋白；

• 保護(hù)蛋白內(nèi)容物不因進(jìn)入循環(huán)而發(fā)生氧化等改變；

• 反映起源細(xì)胞真實(shí)狀況；

• 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞發(fā)揮作用；

• 可在腎濾過(guò)過(guò)程中留在血液中；

• 蛋白質(zhì)濃度范圍與細(xì)胞類(lèi)似，易檢測(cè)。

EV的異質(zhì)性、低豐度及與血漿中某些成分的相似性使得其分離與研究面臨挑戰(zhàn)。超速離心、尺寸排阻、免疫捕獲及能夠銜接自動(dòng)化設(shè)備的新興技術(shù)強(qiáng)陰離子交換（SAX）磁珠（廈門(mén)普睿邁格公司的SAX磁珠http://www.5000js.com/Product/2438711623.html）已被應(yīng)用于血液中EV的富集。2023年12月發(fā)表的國(guó)際細(xì)胞外囊泡研究指南（MISEV2023）與2024年8月發(fā)表的《細(xì)胞外囊泡分離與檢測(cè)技術(shù)專家共識(shí)》對(duì)EV的定義與標(biāo)準(zhǔn)化研究方法進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明。值得注意的是，國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì) （ISEV） 自 2014 年以來(lái)發(fā)布了“細(xì)胞外囊泡研究的最低信息”（MISEV https://www.isev.org/misev） 指南。這項(xiàng)工作應(yīng)指導(dǎo)細(xì)胞外囊泡場(chǎng)的方案和報(bào)告的標(biāo)準(zhǔn)化，以提高 EV 研究的可重復(fù)性和質(zhì)量。這一點(diǎn)至關(guān)重要，因?yàn)榉桨傅奈⑿∽兓邕x擇一致的樣品起始材料（血漿制備或血清），可能會(huì)對(duì) EV 的數(shù)量產(chǎn)生重大影響。

post-translational Modifications─Beyond the Canonical Proteome
翻譯后修飾 ─ 超越規(guī)范蛋白質(zhì)組

       除了經(jīng)典蛋白外，翻譯后修飾 （PTM） 的景觀還提供了一個(gè)生物學(xué)相關(guān)層來(lái)表征循環(huán)蛋白質(zhì)組。PTM 以多種方式影響蛋白質(zhì)，包括溶解度、結(jié)構(gòu)、配體結(jié)合、定位、穩(wěn)定性、分泌和活性。LC-MS 具有 400 多種已知的修飾，是研究大量 PTM（如糖基化、磷酸化、甲基化/?；头核鼗┑膹?qiáng)大技術(shù)。PTM 之間的串?dāng)_產(chǎn)生了另一層復(fù)雜性，導(dǎo)致修飾的復(fù)雜組合微調(diào)生物學(xué)結(jié)果。從歷史上看，大多數(shù)研究?jī)H關(guān)注一種類(lèi)型的 PTM，但最近，PTM 組合和串?dāng)_已被表征和研究。在這里，我們重點(diǎn)介紹了在血漿蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)的兩種類(lèi)型的 PTM：糖基化和磷酸化。

       在血液樣本中，糖基化修飾尤受關(guān)注。糖基化的變化與多種生理和病理過(guò)程相關(guān)，但由于糖鏈結(jié)構(gòu)的高度異質(zhì)性，蛋白質(zhì)糖基化的分析具有挑戰(zhàn)性。在最近的一篇綜述中，Chernykh等人強(qiáng)調(diào)質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步使得人們能夠分辨數(shù)千種N/O-連接的糖結(jié)構(gòu)，探索蛋白與其糖基化形式之間的相關(guān)性。多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）等基于質(zhì)譜的靶向方法也被用于糖基化蛋白質(zhì)的檢測(cè)，如評(píng)估健康人血漿中159 種糖肽的豐度，繪制蛋白質(zhì)內(nèi)和蛋白質(zhì)間的糖基化相關(guān)性圖譜，區(qū)分參與者的年齡和性別。糖基轉(zhuǎn)移酶在疾病進(jìn)展期間經(jīng)常發(fā)生失調(diào)，因此血液糖基化蛋白質(zhì)組同樣可應(yīng)用于疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等研究。有研究表明，糖蛋白有助于卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌和肝癌等的臨床結(jié)果、疾病進(jìn)展或風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，識(shí)別特定的病理亞型或監(jiān)測(cè)治療途徑。早期診斷公司正在利用這些糖基化變化建立基于血液的診斷測(cè)試。針對(duì)糖基化，廈門(mén)普睿邁格開(kāi)發(fā)了苯硼酸磁珠（http://www.5000js.com/Product/379210028.html）用于富集糖基化蛋白和多肽。

       與蛋白質(zhì)糖基化一樣，在血液蛋白質(zhì)組中也觀察到磷酸化。雖然這些修飾蛋白在循環(huán)中出現(xiàn)的機(jī)制有很多，但有三種機(jī)制包括高爾基體介導(dǎo)的對(duì)主動(dòng)分泌蛋白的磷酸化、在細(xì)胞外修飾蛋白的分泌激酶以及細(xì)胞死亡或相關(guān)事件中的泄漏蛋白。針對(duì)磷酸化，廈門(mén)普睿邁格開(kāi)發(fā)了二氧化鈦磁珠（http://www.5000js.com/Product/1325064453.html）、IMAC-Ti磁珠(http://www.5000js.com/Product/7583104713.html)、IMAC-Zr磁珠(http://www.5000js.com/Product/6152704851.html)和NTA-Fe磁珠（http://www.5000js.com/Product/2819731545.html）用于富集磷酸化蛋白和多肽。

        幾項(xiàng)大規(guī)模發(fā)現(xiàn)研究幫助對(duì)其中一些細(xì)胞外和循環(huán)磷蛋白進(jìn)行了分類(lèi)，揭示了與疾病進(jìn)展、治療和/或監(jiān)測(cè)相關(guān)的有趣機(jī)制。

Networks and Connections of Circulating Proteins
循環(huán)蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)和連接
       定義亞蛋白質(zhì)組的一種方法是它們?cè)谌后w或網(wǎng)絡(luò)中的共調(diào)控，這可能會(huì)確定不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。共調(diào)節(jié)的原因可以在各種機(jī)制中找到，從器官或組織泄漏到循環(huán)細(xì)胞的存在、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復(fù)合物、聚集到脂蛋白顆粒、EV 或?qū)μ囟ù碳さ姆磻?yīng)。

       通常，組織滲漏蛋白是器官損傷的臨床標(biāo)志物（見(jiàn)肌鈣蛋白）或用于檢測(cè)由于癌癥相關(guān)蛋白（如 CA125）異常分泌而導(dǎo)致的癌癥，以早期檢測(cè)卵巢癌。除了疾病背景之外，組織滲漏蛋白可以起源于生物過(guò)程。然而，由于它們的豐度、組織特異性和不太一致的存在，檢測(cè)更廣泛的組織滲漏蛋白非常局限于 COVID-19 等嚴(yán)重表型。 使用肽的等電聚焦和基于 MS 的讀數(shù)，最近的一項(xiàng)研究報(bào)告了懷孕期間循環(huán)中釋放的胎盤(pán)特異性蛋白。將其與遺傳信息（表示為蛋白質(zhì)基因組學(xué)）相結(jié)合，使該研究能夠?qū)⒛切z測(cè)到的具有特定單氨基酸變體的肽分配給胎兒或母親。這表明孩子和母體循環(huán)系統(tǒng)之間存在跨胎盤(pán)交換。在一項(xiàng)與酒精相關(guān)的肝病研究中，配對(duì)的肝-血漿樣本可用于識(shí)別參與活性信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的組織損傷標(biāo)志物和蛋白質(zhì)。

      除了應(yīng)用差異豐度統(tǒng)計(jì)來(lái)識(shí)別共調(diào)控蛋白質(zhì)外，基于網(wǎng)絡(luò)的方法還是獲得對(duì)蛋白質(zhì)的更深入生物學(xué)理解或減少下游統(tǒng)計(jì)分析共線性的寶貴工具。對(duì)于具有低倍數(shù)變化或高個(gè)體間差異的蛋白質(zhì)尤其如此，大部分蛋白質(zhì)組都是這種情況。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)方法，如加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），使用成對(duì)數(shù)據(jù)描述不同組別之間的相關(guān)關(guān)系。將相關(guān)性矩陣與聚類(lèi)算法結(jié)合，可以構(gòu)建“全局相關(guān)圖”，捕捉指向物理互作或功能關(guān)聯(lián)的特征。相關(guān)性分析與臨床參數(shù)或參與者信息的關(guān)聯(lián)可為潛在生物學(xué)機(jī)制提出假設(shè)，進(jìn)一步結(jié)合GO或KEGG富集分析揭示更多生物學(xué)線索。

血漿蛋白質(zhì)組未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

在血漿蛋白質(zhì)組領(lǐng)域，適用性、深度、通量和檢測(cè)速度的增加是近年及未來(lái)的自然發(fā)展趨勢(shì)。未來(lái)幾年中，血漿蛋白質(zhì)組的發(fā)展趨勢(shì)包括：

• 提高檢測(cè)深度，鑒定所有類(lèi)型樣本中的所有循環(huán)蛋白；

• 對(duì)鑒定到的血漿蛋白提供進(jìn)一步的可靠證據(jù)；

• 對(duì)血漿蛋白提供可靠的定量信息與濃度信息；

• 關(guān)注血液中的細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組、翻譯后修飾組等其他類(lèi)別蛋白；

• 探索血漿蛋白之間的關(guān)系及對(duì)生物學(xué)功能的映射；

• 構(gòu)建嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉颖静杉苽浼皹?biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)體系；

• 識(shí)別血漿蛋白質(zhì)中的異構(gòu)體與未知變異。

血液樣本的易獲取性使人們能夠使用新的更為頻繁的采樣方案來(lái)確定全身性的分子健康軌跡。針對(duì)更大隊(duì)列的研究可以提高檢測(cè)微小效應(yīng)、復(fù)雜特征（即許多蛋白質(zhì)組成一個(gè)獨(dú)特的模式）或與隊(duì)列子集相關(guān)的變化的能力。