老鳥們的DNA/RNA 抽提（提取）技巧分享
分子生物實(shí)驗(yàn)核酸的抽提作為整個生物領(lǐng)域最基礎(chǔ)的一個實(shí)驗(yàn)，已漸漸被大家所淡忘。市場上的樣本處理及抽提方法的越來越多，大家越來越把自己的研究重心，放在下游更為重要的實(shí)驗(yàn)。而對于樣本的處理和抽提，更多的人選擇試劑盒，而很少會考慮到樣品本身，或者抽提過程一些遇到的問題。這篇備忘錄旨在針對剛開始接觸核酸抽提實(shí)驗(yàn)的同學(xué)做一些簡要的介紹，對已常年浸潤于分子實(shí)驗(yàn)的老鳥們做一些善意的提醒。希望大家在看過這篇備忘錄之后，對于不同的樣品抽提能有更多的感悟。我這里拋磚引玉，也希望大家不吝賜教。
樣品的前處理
分子實(shí)驗(yàn)中需要抽提的主要樣本大致分為這幾類: 血液、細(xì)胞、組織、體液、微生物。核酸的抽提，不同的樣本之間存在不一樣的特性，在選擇抽提方式的時候，也要盡量辨別。例如：
1. 細(xì)胞中植物細(xì)胞相較于動物細(xì)胞更難裂解，選擇裂解液和裂解方式的時候需要格外注意。一般的研磨缽可能對于組織及一般的細(xì)胞比較好用，但是植物細(xì)胞往往需要使用液氮加機(jī)械裂解的方法。
2. 對于革蘭氏陽性菌和真菌還需要加入溶菌酶和蛋白酶來輔助裂解，不然提出來的量真是慘不忍睹。
3. 食品的樣本往往需要特殊的提取試劑盒，不然在深加工的過程中，高溫高油脂帶來的PCR抑制效果非常明顯，市面上Purimag 系列、ThermoFisher的PrepSEQ系列、QIAGEN的Mericon系列等。
這里想到自己之前遇到過的情況，在裂解神經(jīng)組織的時候，大部分人可能覺得和一般的組織的抽提并無區(qū)別，但是恰恰相反，神經(jīng)組織作為有髓鞘包裹的組織，在大腦中脂質(zhì)含量又比較高，所以屬于比較難提取的一類組織。個人推薦液使用液氮加機(jī)械研磨的方法來預(yù)處理樣本，并在后續(xù)的提取過程中選取相關(guān)公司提取脂質(zhì)的試劑盒來提取。
說到機(jī)械破碎儀，市面上很多公司都有破碎儀銷售，方法大致是通過高頻率的震蕩來使細(xì)胞破碎，釋放里面的核酸，例如QIAGEN的Tissuelyser系列。這里需要注意的是，超聲破碎儀盡量避免使用，高頻率的聲波會將DNA片段化，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
抽提方法
目前市面主要的抽提試劑盒，大致分為三類：磁珠法、沉淀法、柱法。每種方法各有各的優(yōu)缺點(diǎn)。
磁珠法提取的片段長度較長，且完整，適用于下游二代測序，基因文庫構(gòu)建等應(yīng)用。但是，其提取效率與磁珠和核酸的親和性直接相關(guān)，這導(dǎo)致了有時候穩(wěn)定性不會很好，并且各個廠家的磁珠捕獲能力也不盡相同，其中國產(chǎn)的purimag磁珠（www.5000js.com）和天根磁珠(www.tiangen.com)都是其中的佼佼者。
沉淀法以Life的Trizol法為代表，個人感覺應(yīng)該是目前是使用比較廣泛的一種方法。其利用試劑將DNA層，RNA層分開，直觀，方便。后期使用異丙醇將DNA，RNA析出并純化的方法，可以滿足絕大多數(shù)的分子生物實(shí)驗(yàn)。但是缺點(diǎn)往往也由于加入了不少的有機(jī)試劑，DNA/RNA分層有時候不易區(qū)分，導(dǎo)致了提取出來的核酸純度不夠，造成濃度虛高的假象。很多實(shí)驗(yàn)室會自己設(shè)計核酸提取步驟，大多數(shù)也是基于這個原理，先加入高鹽裂解液，然后分離核酸，純化。
另外，個人推薦大家關(guān)注一家目前市面較為新的一家公司賽佩（Cepheid），前兩天剛剛40億美元被Danaher收購了，他們家的Xpert? 系列，smartcycler等樣品處理器，設(shè)計與目前市場的其他類產(chǎn)品都不大一樣，屬于分子診斷界的一股清流。
抽提溫度
一般核酸的抽提操作溫度都是常溫（15-25攝氏度），這點(diǎn)可能大多數(shù)人不會特別注意到。一般在常溫離心的時候，離心機(jī)轉(zhuǎn)速過快導(dǎo)致離心機(jī)內(nèi)溫度升高，以至于機(jī)內(nèi)溫度高于了室溫的情況也是有的。特別是在提取RNA的時候，過高的操作溫度導(dǎo)致RNA降解，還是時有發(fā)生。例如在Trizol抽提的時候，有些人會在加入異丙醇讓DNA/RNA析出的時候，為了防止溫度過高，設(shè)置離心機(jī)溫度為10攝氏度，來抵消離心機(jī)溫度上升的影響。
離心機(jī)轉(zhuǎn)速
離心機(jī)轉(zhuǎn)速看似不是很重要，但是往往很多人會忽略。之前又遇到過RPM和RCF (g) 傻傻分不清的同學(xué)，所以給大家簡單的復(fù)習(xí)一下RCF = 1.12×10－5×(rpm)2 r。一般低速離心使用RPM表示而高速使用g。大家抽提的時候可以注意一下轉(zhuǎn)速的要求，往往提高轉(zhuǎn)速或者在轉(zhuǎn)速達(dá)不到要求的情況下延長離心時間，會對提取有一定的幫助。
DNA/RNA污染
其實(shí)DNA/RNA污染在抽提的過程中很普遍，例如Trizol抽提時，分層不是很明顯，錯將一部分DNA吸入RNA的層，也是時有發(fā)生。使用柱提法的試劑盒，膜的親和性并不能完全保證對于DNA/RNA的專一性等情況，都會造成抽提時候的污染。
其實(shí)根據(jù)個人下游實(shí)驗(yàn)的需求不同，對于DNA/RNA的污染要求也不同。目前市面上的抽提試劑盒，基本不可能保證完全保證抽提的完全純度，少量的DNA/RNA殘留是可以被允許的，不影響大部分的實(shí)驗(yàn)。之前遇到過有人拿某品牌RNA的抽提試劑盒，來抽提病毒DNA，抽出的拷貝數(shù)RT-PCR檢測后能達(dá)到10^5個。所以大家在選擇購買試劑盒的時候，可以咨詢一下技術(shù)人員，是否能將DNA或者RNA去除干凈。如果下游對于DNA/RNA純度要求較高，如建庫，測序等，需要在抽提過程或者抽提結(jié)束后加入相應(yīng)的DNA酶或者RNA酶消化，純化。
核酸質(zhì)量
目前最流行的方法是nanodrop測量核酸的OD值。通過測量整個溶液的260/280，260/230來確認(rèn)提取的質(zhì)量。其中， 280nm是蛋白質(zhì)的吸收峰, 260nm是NA的吸收峰230nm是有機(jī)物的吸收峰，一般是乙醇。所以260/280就是反應(yīng)提取的蛋白質(zhì)污染的水平。260/230反應(yīng)的就是有機(jī)污染的水平。一般來說260/280的比值在1.7-2.0之間260/230的比值在1.8-2.1之間，個人經(jīng)驗(yàn)來說比值上下浮動0.2可以被允許。 過高的260/230也是存在的，之前自己有碰到過提取出260/230大于10的情況，但是后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒有影響。個人猜測是酒精去除的較為干凈，導(dǎo)致260相對于230很高。如果DNA降解，260/280變高，所以小伙伴們遇到260/280過高的情況就要警惕了。另外一個較為流行的方法是使用Thermo的Qubit或者QIAGEN 的QIAxpert。他們可以分別測量提取的溶液中單鏈成份和雙鏈成份的比值，測出來更精確，也更直觀。
另外，凝膠電泳分析也往往是必要的。個人建議提取完核酸之后有條件一定要進(jìn)行凝膠電泳的質(zhì)量驗(yàn)證。可以看出DNA/RNA的完整性，相對的濃度，還有片段大小是否符合，可以說一個凝膠電泳，可以讓我對儀器讀出的值，有一個更直觀的感受。在這里我也有幾點(diǎn)需要提醒大家。第一點(diǎn)是希望大家選擇正確的凝膠類型。第二點(diǎn)是希望大家選擇正確的跑膠電壓，時間還有方向。第三點(diǎn)希望大家點(diǎn)樣的時候盡可能的先稀釋核酸，過多的核酸會讓核酸擠在泳道內(nèi),使其完全跑不開。
可能大家看到這兩點(diǎn)會不禁笑出聲來，這么基礎(chǔ)的東西為什么也需要列舉出來。但是，由于個人工作的關(guān)系，已經(jīng)不下10次的遇到電壓剛才我提及的三個問題了。在這里個人再做一個提醒，核酸選用瓊脂糖凝膠電泳，電壓盡量不要超過110V，時間不要超過45分鐘就可以了，我們需要看到的僅僅是分開清晰的條帶，并不需要把各個條帶跑多開。個人經(jīng)驗(yàn)來說DNA 90v跑15到30分鐘就可以有比較漂亮的條帶出來了。RNA為了防止降解，可以選擇使用140v，5分鐘來跑。如果不是很確定自己的條件是否合適，可以觀察自己的Marker，如果連marker都在膠板上消失了，可以考慮一下我上面提到的條件。
在儀器方面，比較經(jīng)典的儀器是安捷倫的2100可以通過DIN值，還有RIN值來測量DNA和RNA的完整性。測序公司可能會需要兩個值大于6才能通過質(zhì)控，但是經(jīng)驗(yàn)來說一般的分子實(shí)驗(yàn)大于5就可以了。其他儀器還有QIAGEN的QIAxpert系列目前做的也比較好。
核酸抽提儀
另外，除了上面提到的手動抽提試劑盒，更多的公司選擇研發(fā)自動化的工作平臺。這些平臺抽提效率高，抽提重復(fù)性好，節(jié)省時間，在目前的市場上很暢銷。例如對于一些少量樣本的處理儀比較有名的如ABI，QIAGEN的QIAcube 24，Promega的 maxwell 16， 天根的Tguide 16。對于高通量的樣本有Rocher的 magNA pure 96， QIAGEN的 QIAcube HT, ABI的magmax express 96。另外QIAGEN還有大型工作站QIAsymphony SP/AS 可以將樣品制備和PCR體系的構(gòu)建結(jié)合，目前國內(nèi)唯一。另外,還有一些國產(chǎn)抽提儀，就不一一列舉了。這些提取儀特別是基于磁珠法的提取儀均能與purimag的DNA提取磁珠完美配合。
小結(jié)
核酸提取是一個說簡單不簡單，說復(fù)雜不復(fù)雜的小型實(shí)驗(yàn)。但是實(shí)驗(yàn)本身會對我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。個人曾見過一些核酸提取質(zhì)量不過關(guān)，導(dǎo)致后續(xù)PCR擴(kuò)增不出來，測序公司質(zhì)控不通過，RT-PCR擴(kuò)增效率低等問題。就在剛剛，有人向我抱怨說測序公司退回了他的樣品，他的RNA已經(jīng)降解。而當(dāng)我問他，“你之前有測過RNA濃度”的時候，他只能張著嘴巴說“我沒有測啊”。一句“沒有測”，會導(dǎo)致你需要去排查的問題，從原來只需要檢查運(yùn)輸儲存條件和提取的耗材問題，增加到從提取開始的大型troubleshooting，最后問題還不一定能夠完全解決。
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