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Saei, A. A., Sun, L., & Mahmoudi, M. (2024). The role of protein corona in advancing plasma proteomics. Proteomics, e2400028. https://doi.org/10.1002/pmic.202400028

摘要：蛋白冠是生物環(huán)境中圍繞納米顆粒形成的生物分子層，嚴(yán)重影響納米顆粒與生物系統(tǒng)的相互作用，影響藥代動(dòng)力學(xué)和生物結(jié)果。最初，蛋白冠給納米醫(yī)學(xué)和納米毒理學(xué)帶來(lái)了挑戰(zhàn)，例如細(xì)胞培養(yǎng)物中的營(yíng)養(yǎng)消耗和納米顆粒靶向物種的掩蓋。然而，最近的進(jìn)展凸顯了它在環(huán)境毒性、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)方面的潛力。該觀點(diǎn)側(cè)重于利用蛋白冠來(lái)提高血漿蛋白質(zhì)組分析的深度，解決血漿中蛋白質(zhì)濃度的高動(dòng)態(tài)范圍帶來(lái)的挑戰(zhàn)。蛋白冠簡(jiǎn)化了樣品制備，富集了低豐度蛋白質(zhì)，并提高了蛋白質(zhì)組覆蓋率。創(chuàng)新包括使用不同的納米顆粒和加標(biāo)小分子來(lái)增加定量蛋白質(zhì)的數(shù)量。核心設(shè)施的可重復(fù)性問(wèn)題需要標(biāo)準(zhǔn)化的方案。此外，自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)形式特異性測(cè)量，從而更深入地了解蛋白冠的組成。未來(lái)的研究應(yīng)旨在改進(jìn)自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，并將蛋白冠研究和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療和高級(jí)診斷。

1 引言
蛋白冠是一層生物分子，主要是蛋白質(zhì)，當(dāng)納米顆粒進(jìn)入生物環(huán)境時(shí)，會(huì)在納米顆粒周圍形成 。該層可以決定納米顆粒與給定生物系統(tǒng)的各種成分（包括免疫細(xì)胞）的相互作用，并決定納米顆粒的藥代動(dòng)力學(xué)和生物命運(yùn)。
 
對(duì)蛋白冠的初步研究主要集中在它給納米醫(yī)學(xué)和納米毒理學(xué)帶來(lái)的挑戰(zhàn) 。例如，在靜態(tài)體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中形成蛋白冠會(huì)耗盡培養(yǎng)基中必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的間接毒性 。這種消耗可能導(dǎo)致納米毒理學(xué)研究的錯(cuò)誤結(jié)果，因?yàn)橛^察到的效果可能是由于培養(yǎng)基成分的消耗，而不是納米顆粒本身的內(nèi)在毒性。在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人們寄予厚望，認(rèn)為納米粒子可以用表面靶向物種（如適配體和抗體）進(jìn)行工程改造，以定位人體中的特定細(xì)胞并與之相互作用。這種靶向遞送旨在將治療分子（如藥物）直接運(yùn)輸?shù)交疾〖?xì)胞（如癌細(xì)胞），從而最大限度地提高療效并最大限度地減少副作用。然而，在實(shí)踐中，在納米顆粒表面形成的蛋白冠通常會(huì)屏蔽這些靶向物種，導(dǎo)致誤靶向和治療效果降低。這種意外的掩蔽效應(yīng)會(huì)損害治療的精確遞送，并降低基于納米顆粒的治療的整體效果。

蛋白冠領(lǐng)域的最新研究為解決各個(gè)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)開(kāi)辟了新的機(jī)會(huì)，包括納米顆粒的環(huán)境毒性、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)。例如，對(duì)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的納米顆粒進(jìn)行蛋白冠分析可用于追蹤其途徑，為風(fēng)險(xiǎn)管理和政策制定提供重要信息，以確保納米顆粒的安全使用，并最大限度地減少其意外釋放到環(huán)境和食物鏈中。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，納米顆?，F(xiàn)在被用來(lái)降低血漿蛋白的復(fù)雜性，從而提高蛋白質(zhì)組覆蓋率并實(shí)現(xiàn)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。此外，操縱蛋白冠可用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，為開(kāi)發(fā)免疫治療劑來(lái)治療免疫系統(tǒng)疾病開(kāi)辟了新的途徑 。在這些新興應(yīng)用中，本觀點(diǎn)側(cè)重于蛋白冠在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的使用。利用蛋白冠可以對(duì)血漿蛋白進(jìn)行更深入的分析，促進(jìn)生物標(biāo)志物的識(shí)別和定量，并最終為開(kāi)發(fā)潛在的診斷和治療策略開(kāi)辟可能性。

2 血漿蛋白質(zhì)組分析的挑戰(zhàn)
血漿蛋白質(zhì)組分析的主要挑戰(zhàn)是血漿中蛋白質(zhì)濃度的高動(dòng)態(tài)范圍。血漿中含有大量蛋白質(zhì)，濃度跨越 12 個(gè)數(shù)量級(jí)，從高豐度蛋白質(zhì)（如白蛋白和免疫球蛋白）到低豐度蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子）。如此廣泛的范圍阻礙了低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和定量，而低豐度蛋白質(zhì)通常對(duì)診斷和治療目的具有重要意義?；谫|(zhì)譜 （MS） 的蛋白質(zhì)組學(xué)是血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主要方法，可以在大約 4-6 個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)，具體取決于所使用的儀器、樣品制備工作流程、色譜和富集技術(shù)。

為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，通常采用各種技術(shù)，如樣品分離、高豐度蛋白質(zhì)的去除和低豐度蛋白質(zhì)的富集，以增強(qiáng)血漿蛋白質(zhì)組的覆蓋率。 在這一領(lǐng)域中，使用蛋白冠是一種新興的方法，具有降低血漿蛋白復(fù)雜性的巨大潛力，因此增加了血漿中低豐度和稀有蛋白質(zhì)的鑒定和定量的機(jī)會(huì)。

3 蛋白 CORONA 如何擴(kuò)增血漿蛋白質(zhì)組分析
3.1 到目前為止，我們知道什么？
蛋白冠可以通過(guò)選擇性地將蛋白質(zhì)吸附到納米顆粒（http://www.5000js.com/Product/8096211554.html）表面來(lái)降低血漿的復(fù)雜性（圖 1）。這種選擇性吸附主要通過(guò)消耗高豐度蛋白質(zhì)和富集低豐度蛋白質(zhì)來(lái)提供幫助，從而降低血漿中蛋白質(zhì)濃度的高動(dòng)態(tài)范圍。這允許檢測(cè)和定量低濃度的蛋白質(zhì)。此外，蛋白冠形成可以通過(guò)簡(jiǎn)化血漿樣品的分級(jí)分離和純化步驟來(lái)簡(jiǎn)化樣品制備，從而提高工作流程的效率并獲得更可重現(xiàn)的結(jié)果。


圖 1

演示蛋白冠如何簡(jiǎn)化血漿蛋白質(zhì)組分析的方案。由于血漿中存在高度豐富的蛋白質(zhì)（如白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合珠蛋白）以及血漿中存在的不同蛋白質(zhì)形式，因此對(duì)血漿蛋白質(zhì)組進(jìn)行基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析具有挑戰(zhàn)性。NPs 可以通過(guò)在其冠狀體中吸附血漿蛋白的特定子集及其蛋白質(zhì)形式來(lái)降低蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)范圍。此外，小分子，尤其是磷脂酰膽堿，可以大大提高吸附蛋白質(zhì)的多樣性，增強(qiáng)血漿蛋白質(zhì)組覆蓋率。磷脂酰膽堿和其他小分子可以結(jié)合白蛋白等高豐度蛋白，阻礙它們?cè)?NP 蛋白冠的吸附。最終，通過(guò)自下而上或自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)血漿蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)形式進(jìn)行深度采樣，可以發(fā)現(xiàn)各種疾病的生物標(biāo)志物，從而了解患者和個(gè)人的整體健康譜。

蛋白冠的一個(gè)主要問(wèn)題是附著在納米顆粒表面的血漿蛋白數(shù)量有限，通常只有幾百個(gè)[16]。為了提高定量血漿蛋白的數(shù)量，已經(jīng)提出了利用一系列具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的納米顆粒。不同類型的納米顆粒對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞群具有不同的親和力。通過(guò)使用一組具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的納米顆粒，可以顯著增加來(lái)自各種蛋白冠的定量血漿蛋白的數(shù)量，從而提供更全面的血漿蛋白質(zhì)組分析。 然而，在此類方案中應(yīng)用多種納米顆粒會(huì)使樣品制備過(guò)程更加勞動(dòng)密集，并降低蛋白質(zhì)組學(xué)分析的可重復(fù)性。

進(jìn)一步提高蛋白冠中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)數(shù)量的另一種策略是在小分子（如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維生素、脂質(zhì)和代謝物）與納米顆粒相互作用之前將其加標(biāo)到血漿中。這些小分子可以與蛋白質(zhì)相互作用，改變/阻斷它們的結(jié)合位點(diǎn)，并在相同的納米顆粒表面產(chǎn)生獨(dú)特的蛋白冠。通過(guò)使用一系列小分子，可以在給定納米顆粒的表面形成不同的蛋白冠。這種方法顯著增加了已鑒定和定量蛋白質(zhì)的數(shù)量，從而提高了使用單個(gè)納米顆粒的血漿蛋白質(zhì)組分析的深度。在測(cè)試的各種小分子中，在納米顆粒蛋白冠形成之前在血漿中加標(biāo)磷脂酰膽堿顯著增加了檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的數(shù)量。使用數(shù)據(jù)非依賴型采集方法，單次 LC-MS 分析可以定量單個(gè)血漿樣品中多達(dá) 1436 種血漿蛋白，而單獨(dú)血漿中可定量 322 種蛋白質(zhì)。磷脂酰膽堿的這種獨(dú)特能力歸因于最豐富的血漿蛋白（包括白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合珠蛋白）的選擇性消耗。磷脂酰膽堿與此類蛋白質(zhì)結(jié)合，阻礙它們與納米顆粒表面的結(jié)合。磷脂酰膽堿同時(shí)消耗高豐度蛋白質(zhì)可以減小血漿蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)范圍，并能夠定量豐度較低的蛋白質(zhì)。

除了增加定量蛋白質(zhì)的數(shù)量外，這種方法還可以選擇性地分析血漿蛋白質(zhì)組的各種亞群，從而降低整體復(fù)雜性并專注于特定的蛋白質(zhì)組。例如，向血漿中添加膽固醇可以增強(qiáng)載脂蛋白與納米顆粒表面的結(jié)合。這種靶向富集允許對(duì)特定蛋白質(zhì)家族進(jìn)行更詳細(xì)的分析，從而有助于在給定的疾病環(huán)境中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。

3.2 我們?nèi)绾卫玫鞍纂姇炦M(jìn)一步提高蛋白冠分析的深度？
納米醫(yī)學(xué)界可以通過(guò)采用各種創(chuàng)新策略來(lái)顯著提高蛋白冠分析的蛋白質(zhì)組學(xué)能力，這些策略應(yīng)在未來(lái)的研究中得到驗(yàn)證和探索。到目前為止，只有有限范圍的小分子被應(yīng)用于人血漿，以利用蛋白冠提高蛋白質(zhì)組覆蓋率。通過(guò)擴(kuò)展這種方法，研究人員可以探索不同類型的生物分子，甚至設(shè)計(jì)特定的新分子，這些分子可以有效中和高豐度蛋白質(zhì)與納米顆粒表面的相互作用。這種策略可能導(dǎo)致鑒定有影響力的（生物）分子，這些分子能夠進(jìn)一步降低高豐度蛋白質(zhì)在納米顆粒表面的優(yōu)勢(shì)，從而允許吸附低豐度蛋白質(zhì)。反過(guò)來(lái)，這將提高納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用中蛋白質(zhì)組分析的深度。

4 核心設(shè)施之間的數(shù)據(jù)可重復(fù)性
4.1 到目前為止我們知道什么？
血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白冠研究的主要挑戰(zhàn)之一是不同核心設(shè)施之間缺乏可重復(fù)性。為了在蛋白冠領(lǐng)域解決這個(gè)問(wèn)題，至關(guān)重要的是要吸取數(shù)十年工作的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，開(kāi)發(fā)可靠的樣品制備方案和統(tǒng)一的報(bào)告系統(tǒng)。這些策略包括涵蓋從蛋白冠制備到其詳細(xì)表征的整個(gè)過(guò)程的方案。然而，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)均勻包被納米顆粒結(jié)果的具體影響尚未得到徹底研究。為了強(qiáng)調(diào)可重復(fù)性問(wèn)題的嚴(yán)重性，我們最近進(jìn)行了一項(xiàng)調(diào)查，將相同的蛋白冠包被樣品送到 17 個(gè)不同的蛋白質(zhì)組學(xué)核心設(shè)施進(jìn)行分析。雖然不同核心一致檢測(cè)到的蛋白質(zhì)子集相關(guān)性良好，但它們只占總定量蛋白質(zhì)的一小部分 （1.8%）（即 4022 種中的 73 種）。不同設(shè)施的蛋白質(zhì)組深度不同，這給不同研究?jī)?nèi)部和之間的蛋白質(zhì)和生物標(biāo)志物檢測(cè)帶來(lái)了偏差。此外，這種不一致性在比較獨(dú)立研究的結(jié)果方面構(gòu)成了重大障礙，并突出了標(biāo)準(zhǔn)化方案和方法的必要性，以提高該領(lǐng)域的蛋白質(zhì)組覆蓋率和可重復(fù)性。

為了解決這個(gè)可重復(fù)性問(wèn)題，我們提出了兩種不同的方法。

第一種方法側(cè)重于使用具有一致參數(shù)的統(tǒng)一方法對(duì)原始數(shù)據(jù)分析進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，包括可變修飾、酶特異性、允許的漏診切割次數(shù)和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率閾值。通過(guò)實(shí)施這種協(xié)調(diào)分析方法，我們顯著提高了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的連貫性，提高了重現(xiàn)性，并將不同核心設(shè)施中一致鑒定的獨(dú)特蛋白質(zhì)的百分比從 1.8% 提高到 35.3%。

第二種方法側(cè)重于協(xié)調(diào)樣品制備的工作流程。我們?cè)趦?nèi)部制備肽，然后分析來(lái)自不同核心設(shè)施的相同肽消化物的 MS 數(shù)據(jù)。根據(jù)我們的初步研究結(jié)果，我們選擇了性能最佳的 Core 進(jìn)行肽分析。我們還研究了使用類似儀器和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫(kù)搜索參數(shù)和數(shù)據(jù)處理工作流程的影響。結(jié)果表明，隨著每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化步驟的實(shí)施，各種蛋白質(zhì)組學(xué)設(shè)施的數(shù)據(jù)一致性顯著、逐步提高。

4.2 我們?nèi)绾芜M(jìn)一步應(yīng)對(duì)可重復(fù)性挑戰(zhàn)？
科學(xué)界在蛋白冠結(jié)果可重復(fù)性方面的進(jìn)展凸顯了蛋白質(zhì)電暈分析中標(biāo)準(zhǔn)化程序的迫切需求，以提高研究之間的數(shù)據(jù)可靠性和可比性。鑒于不同實(shí)驗(yàn)室的不同能力和資源，以及質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，它們還引起了人們對(duì)實(shí)施這些標(biāo)準(zhǔn)的潛在挑戰(zhàn)的關(guān)注。展望未來(lái)，建立蛋白冠分析的通用方案對(duì)于推進(jìn)納米醫(yī)學(xué)至關(guān)重要。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，蛋白冠納米醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)界應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)密切合作，為的質(zhì)譜分析制準(zhǔn)定標(biāo)化方案。通過(guò)采用這些標(biāo)準(zhǔn)策略，我們可以提高蛋白冠研究的一致性和可靠性，確保結(jié)果在關(guān)重要。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，不同研究和實(shí)驗(yàn)室之間具有可重復(fù)性和可比性。納米醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)界應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)密切合作，為

5 蛋白冠的蛋白質(zhì)形式特異性測(cè)量
5.1 到目前為止，我們知道什么？
所有已發(fā)表的蛋白冠蛋白質(zhì)組學(xué)研究都采用了廣泛使用的自下而上的方法，該方法通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)酶消化產(chǎn)生的肽來(lái)識(shí)別和定量蛋白質(zhì)。自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)方法高度敏感且相對(duì)成熟，可以有效地用于測(cè)量蛋白質(zhì)的各種屬性，如豐度、穩(wěn)定性/溶解度、氧化還原狀態(tài)和翻譯后修飾 （PTM）。然而，自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)并不適合研究完整的蛋白質(zhì)形式（圖2）。蛋白形式，顧名思義，是源自同一基因的蛋白質(zhì)的不同形式，在序列（例如截短或切割）、亞型（例如剪接）和 PTM 的累積存在方面存在變化。

圖 2
顯示自下而上和自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)之間用于表征蛋白質(zhì)冠狀病毒蛋白質(zhì)形態(tài)景觀的差異的方案。一種蛋白 a 位于蛋白冠中，具有四種蛋白形式。蛋白形式 （Pr1） 有一個(gè)乙酰化 （Ac） 位點(diǎn);Pr2 具有一個(gè) Ac 和一個(gè)磷酸化 （P） 位點(diǎn);Pr3 有兩個(gè) P 位點(diǎn);Pr4 沒(méi)有任何 PTM。當(dāng)使用自下而上的方法分析樣品時(shí)，由于樣品制備過(guò)程中的樣品損失或電噴霧電離過(guò)程中的電離效率低（例如磷酸化肽），無(wú)法識(shí)別酶處理產(chǎn)生的一些肽。此外，蛋白質(zhì)中的某些區(qū)域不適合使用常用的蛋白酶消化。最后，自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)部分 PTM 信息鑒定蛋白質(zhì)組 a。無(wú)法弄清楚蛋白冠樣品中的蛋白質(zhì)形式，因?yàn)槎喾N蛋白質(zhì)形式組合可以產(chǎn)生相同的肽庫(kù)，并且該方法無(wú)法識(shí)別所有肽和 PTM 信息。對(duì)于自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)，在 MS 和 MS/MS 之前通過(guò)液相色譜或毛細(xì)管電泳分離完整的蛋白質(zhì)形式。四種不同的蛋白質(zhì)形式可以通過(guò)它們的不同質(zhì)量來(lái)檢測(cè)和區(qū)分。蛋白質(zhì)形式之間的質(zhì)量變化為當(dāng)前的 PTM 提供了信息。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)能夠提供蛋白質(zhì)冠的蛋白質(zhì)形式景觀。

已經(jīng)充分證明，來(lái)自同一基因的蛋白質(zhì)形式可以具有不同的生物學(xué)功能。例如，一項(xiàng)對(duì)選擇性剪接引起的蛋白質(zhì)形式的整體功能研究表明，其中許多蛋白質(zhì)形式在功能上表現(xiàn)為來(lái)自不同基因的不同蛋白質(zhì)，而不是彼此的微小變異。以蛋白質(zhì)形式特異性方式表征蛋白冠對(duì)于改善從人血漿中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物并開(kāi)發(fā)更有效的納米藥物至關(guān)重要。

最近，我們開(kāi)創(chuàng)了一種有效且穩(wěn)定的基于 MS 的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，用于測(cè)量聚苯乙烯納米顆粒與健康人血漿樣品孵育后蛋白冠中的蛋白質(zhì)形式?；?MS 的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)使用 MS 和串聯(lián) MS （MS/MS）直接測(cè)量完整蛋白質(zhì)，是揭示蛋白冠蛋白質(zhì)形態(tài)的理想選擇（圖 2）。我們的工作流程包括：與人血漿樣品孵育后，使用去污劑溶液（即十二烷基硫酸鈉，SDS）從納米顆粒中洗脫蛋白冠，通過(guò)緩沖液交換進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，以及毛細(xì)管區(qū)間電泳 （CZE）-MS [33， 34] 和 MS/MS 分析。我們的方法已成功在聚苯乙烯納米顆粒的蛋白冠中鑒定出數(shù)百種質(zhì)量范圍為 3-70 kDa 的蛋白質(zhì)形式。我們揭示了 20 多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的多種蛋白質(zhì)形式，以及 PTM 、信號(hào)肽切割和/或截?cái)嗟慕M合。這種分析不適合自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其中信息通?？偨Y(jié)為包含多種可能蛋白質(zhì)的“蛋白質(zhì)組”（圖 2）。這些數(shù)據(jù)突出了自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)可以為蛋白質(zhì)冠的表征增加的價(jià)值。展望未來(lái)，需要做出更多努力，從自上而下的測(cè)量來(lái)提高蛋白質(zhì)組覆蓋率和蛋白質(zhì)形式表征的質(zhì)量，尤其是大型蛋白質(zhì)形式。更先進(jìn)的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有更好的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備、分離、MS 檢測(cè)、氣相碎裂以及生物信息學(xué)鑒定和定量是核心。另一方面，從大量疾病相關(guān)人類血漿樣本中自上而下地測(cè)量蛋白冠，尤其是與一系列納米顆粒結(jié)合，是發(fā)現(xiàn)疾病特異性蛋白質(zhì)形式生物標(biāo)志物的下一個(gè)關(guān)鍵步驟。

5.2 自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)如何增強(qiáng)我們對(duì)蛋白冠的理解？
總體而言，自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)不如自下而上的方法發(fā)達(dá)，特別是在蛋白冠研究的背景下。盡管其意義重大，但只有少數(shù)研究探討了蛋白冠的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)。這種方法使納米醫(yī)學(xué)界能夠更深入地了解蛋白冠的功能及其在疾病檢測(cè)中的作用。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)特別有價(jià)值，因?yàn)樗峁┝擞嘘P(guān)蛋白質(zhì)形式的詳細(xì)信息，可以揭示疾病發(fā)生和進(jìn)展的潛在機(jī)制。

未來(lái)的研究應(yīng)側(cè)重于利用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)的獨(dú)特能力來(lái)更好地定義納米顆粒的生物命運(yùn)。由于蛋白質(zhì)形式提供了對(duì)蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的更精確見(jiàn)解，因此這種方法可以幫助預(yù)測(cè)生物系統(tǒng)（包括免疫細(xì)胞）將如何響應(yīng)納米顆粒。為了全面了解蛋白冠在診斷和治療中的應(yīng)用，我們建議未來(lái)的研究旨在提高蛋白質(zhì)形式表征的覆蓋率和質(zhì)量。為了提高蛋白冠的蛋白質(zhì)形態(tài)覆蓋率，必須付出更多努力來(lái)推進(jìn)樣品制備（即從納米顆粒中洗脫蛋白冠并在自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)量之前進(jìn)行凈化）、蛋白質(zhì)形態(tài)分離的峰容量和 MS 檢測(cè)的靈敏度。例如，應(yīng)探索新技術(shù)，例如溶解核心納米顆粒，以允許在納米顆粒表面完全恢復(fù)完整的蛋白質(zhì)形式。此外，可以探索天然 CZE-MS 以更好地測(cè)量大蛋白質(zhì)形式。為了提高蛋白質(zhì)形式表征的質(zhì)量，我們需要通過(guò)研究不同的片段化技術(shù)并整合自上而下和自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)提高蛋白質(zhì)形式片段化的覆蓋率。 PTM 自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)提供的豐富信息對(duì)于更準(zhǔn)確地解釋自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白質(zhì)形態(tài)水平數(shù)據(jù)非常有用。還需要特別注意使用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行蛋白冠研究的可重復(fù)性。必須應(yīng)用從自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)中吸取的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，并將其應(yīng)用于自上而下的方法。

應(yīng)該在開(kāi)發(fā)新的策略/方法上做出更多努力，以從納米顆粒表面完全去除所有蛋白質(zhì)以進(jìn)行自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。目前，由于納米生物界面處的復(fù)雜作用力，幾乎不可能實(shí)現(xiàn)從納米顆粒表面完全去除蛋白質(zhì)以進(jìn)行全面表征。然而，藥物遞送領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn)提供了潛在的解決方案。在藥物遞送中，聚合物載體通常使用對(duì)蛋白質(zhì)中性的特異性溶液去除或消化，從而能夠收集和分析釋放的蛋白質(zhì)?；谶@一概念，制備用于更安全、更有效治療應(yīng)用的個(gè)性化納米顆粒的最新進(jìn)展表明，可以消化蛋白冠涂層的金納米顆粒的金核，留下柔軟的蛋白質(zhì)納米殼。這種方法可以適用于蛋白質(zhì)電暈的完整蛋白質(zhì)組學(xué)分析。然而，必須為每種類型的納米顆粒開(kāi)發(fā)量身定制的方案，以有效地消化核心材料，同時(shí)保持蛋白質(zhì)外殼的完整性。這將允許對(duì)蛋白冠進(jìn)行更完整和準(zhǔn)確的分析，從而增強(qiáng)我們對(duì)其組成和潛在治療應(yīng)用的理解。值得一提的是PuriMag公司開(kāi)發(fā)的蛋白冠前處理磁珠（http://www.5000js.com/Product/8096211554.html），具有豐富的表面特性，可以針對(duì)不同蛋白亞群的低豐度蛋白形成富集，未蛋白組學(xué)前處理研究提供了無(wú)限可能。


6 展望
蛋白冠是納米醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)交叉的關(guān)鍵因素，通過(guò)選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)提供顯著的好處。這個(gè)過(guò)程耗盡了高豐度蛋白質(zhì)，從而富集了低豐度蛋白質(zhì)，并促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物所必需的蛋白質(zhì)的分析。盡管有這些好處，但蛋白冠的研究仍處于早期階段，仍然存在許多挑戰(zhàn)。這些研究包括了解蛋白質(zhì)-納米顆粒相互作用的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)，預(yù)測(cè)在小分子和不同生物環(huán)境存在下蛋白冠的組成，并將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。由于雜質(zhì)會(huì)在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中引入錯(cuò)誤，因此該領(lǐng)域的另一個(gè)挑戰(zhàn)是開(kāi)發(fā)和采用穩(wěn)健的策略來(lái)確保蛋白冠保持不含蛋白質(zhì)雜質(zhì) 。各種類型的雜質(zhì)及其處理策略已在文獻(xiàn)中進(jìn)行了廣泛討論。

蛋白冠研究最有前途的進(jìn)展之一是自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)的整合。與更成熟的自下而上的方法不同，自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)允許直接分析完整的蛋白質(zhì)形式——蛋白質(zhì)的特異性變體，可以為疾病機(jī)制和納米顆粒-細(xì)胞相互作用提供重要的見(jiàn)解。我們預(yù)計(jì)，隨著自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以更好地覆蓋和表征蛋白質(zhì)形式，蛋白冠的蛋白質(zhì)形式特異性測(cè)量將徹底改變我們對(duì)生物系統(tǒng)中納米顆粒行為的理解，并為從人血漿中發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)形式生物標(biāo)志物打開(kāi)大門。

為了進(jìn)一步提高蛋白冠在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中的能力，研究人員應(yīng)該探索超越當(dāng)前方法的創(chuàng)新策略。這包括開(kāi)發(fā)新型生物分子或小分子，這些生物分子或小分子可以選擇性地調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在納米顆粒表面的吸附，從而提高對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)。此外，從納米顆粒表面完全去除蛋白質(zhì)的新方法可以使用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)蛋白冠進(jìn)行更徹底的分析，從而更深入地了解其組成和功能。另一個(gè)有前途的途徑是探索個(gè)性化納米顆粒，它可以根據(jù)特定的生物環(huán)境或疾病狀態(tài)進(jìn)行定制。通過(guò)定制納米顆粒核心和表面特性，研究人員可以創(chuàng)建蛋白冠，這些蛋白冠針對(duì)特定疾病指定的獨(dú)特蛋白質(zhì)子集的檢測(cè)進(jìn)行了優(yōu)化。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析、計(jì)算建模和機(jī)器學(xué)習(xí)算法的進(jìn)步對(duì)于應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)至關(guān)重要。這些工具可以幫助破譯蛋白質(zhì)和納米顆粒之間的復(fù)雜相互作用，從而在臨床環(huán)境中實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和定制應(yīng)用。

最近在蛋白冠領(lǐng)域引入的實(shí)際因果關(guān)系（即特定事件或條件之間的精確因果關(guān)系）的概念將提供更精確的理解影響蛋白質(zhì)電暈組成的因素。這些因素包括納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)，例如大小、形狀和電荷、等離子體來(lái)源和生物環(huán)境。

擴(kuò)大實(shí)際因果關(guān)系在蛋白質(zhì)電暈研究中的應(yīng)用可以促進(jìn)高通量預(yù)測(cè)能力的發(fā)展，從而允許為特定應(yīng)用量身定制的納米顆粒的精確設(shè)計(jì)。這種方法可以顯著提高基于納米顆粒的診斷和治療在不同疾病環(huán)境中的有效性和特異性。

隨著對(duì)蛋白冠的理解加深，它與個(gè)性化醫(yī)學(xué)和高級(jí)診斷的整合變得越來(lái)越可行。通過(guò)利用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)提供的獨(dú)特蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜，研究人員可以為個(gè)體患者開(kāi)發(fā)更精確的診斷工具和治療策略。這種方法可以識(shí)別新的生物標(biāo)志物并開(kāi)發(fā)更有效且副作用更少的靶向治療方法。

總之，蛋白冠研究的未來(lái)在于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步、方法的標(biāo)準(zhǔn)化以及突破當(dāng)前知識(shí)界限的創(chuàng)新策略的探索。通過(guò)解決這些關(guān)鍵領(lǐng)域，科學(xué)界可以釋放蛋白質(zhì)冠蛋白質(zhì)組學(xué)的全部潛力，為納米醫(yī)學(xué)、疾病檢測(cè)和個(gè)性化醫(yī)療保健的突破性發(fā)現(xiàn)鋪平道路。

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