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（一）亞氨酸酯類
亞氨酸酯類交聯(lián)劑可與伯氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。形成的酰胺鍵是質(zhì)子化的，所以在生理pH條件下帶有正電荷。亞氨酸酯類的同雙官能團(tuán)交聯(lián)劑常用于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、膜表面分子相互作用及蛋白質(zhì)分子固相表面固定等方面的研究。此外，亞氨酸酯類的交聯(lián)劑還可以作為戊二醛的替代物用于組織固定。亞氨酸酯類的交聯(lián)劑可以自由通透細(xì)胞膜，所以可以交聯(lián)膜蛋白，研究膜構(gòu)成、結(jié)構(gòu)和蛋白-蛋白相互作用及蛋白-脂質(zhì)相互作用。此類交聯(lián)劑還可以用于研究多亞基復(fù)合體內(nèi)部不同亞基的數(shù)量和相互定位。此種反應(yīng)中，通常使用過量的交聯(lián)劑（100-1000倍）和低濃度蛋白（ <1mg/ml），以提高分子內(nèi)部的交聯(lián)效率。

亞氨酸酯類交聯(lián)劑在堿性條件下可以與氨基發(fā)生快速反應(yīng)，但是其半衰期很短。如果pH值再增加，那么半衰期和氨基反應(yīng)性也會相應(yīng)提升。所以，pH10的條件下，交聯(lián)效率高于pH8的條件。雖然酰胺鍵形成的最佳條件是pH8-10，但是當(dāng)pH值低于10時容易發(fā)生副反應(yīng)。使用單功能的烷基亞胺酯的研究表明，pH值小于10時，交聯(lián)反應(yīng)只在一個亞氨酸酯基團(tuán)上發(fā)生。中間產(chǎn)物N-烷基亞胺酯在低pH值條件下形成，會與相鄰氨基反應(yīng)形成N，N+ -酰胺衍生物，這種衍生物最終也可形成酰胺鍵或是其他副產(chǎn)物。當(dāng)pH值大于10時，亞氨酸酯類交聯(lián)劑形成的酰胺鍵可以斷裂，所以為尋求更為有效穩(wěn)定的交聯(lián)效果才出現(xiàn)了NHS酯類交聯(lián)劑。


（二）N-羥基琥珀酰亞胺酯類（NHS酯）
NHS酯可以在生理pH值條件下和伯氨基形成十分穩(wěn)定的酰胺鍵。蛋白質(zhì)N端的a-氨基和賴氨酸殘基的e-氨基都可以與NHS酯形成酰胺鍵。

NHS酯與伯氨基形成十分穩(wěn)定的酰胺鍵后，釋放出N-羥基琥珀酰亞胺。NHS酯遇水會發(fā)生水解反應(yīng)，并且水解的速度隨著pH值的增加而增加。如果蛋白質(zhì)溶液濃度較低的話，那么NHS酯水解反應(yīng)就會穩(wěn)定進(jìn)行。PH7.0和0℃的條件下，雙官能團(tuán) NHS酯交聯(lián)劑在無伯氨基水溶液中的水解半衰期為4耀5個h。如果pH值8.6和4℃條件下，時間會縮短為10min。NHS酯交聯(lián)劑在無伯氨基水溶液中的水解程度可以通過260nm的OD值來檢測。NHS酯水解后釋放的N-羥基琥珀酰亞胺會造成OD260nm值的升高。水解生成的N-羥基琥珀酰亞胺在pH9條件下260nm的分子消光系數(shù)為8.2×103/（cm·mol/L）。在pH6.5的50mmol/L磷酸鉀緩沖溶液中的分子消光系數(shù)為7.5×103/（cm·mol/L）。

NHS酯可以在無伯氨基的離子緩沖溶液中與蛋白的伯氨基發(fā)生特異的交聯(lián)反應(yīng)。常用的緩沖體系包括濃度在50耀20mmol/L之間的磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、HEPES或硼酸鹽緩沖溶液。Tris堿含有伯氨基所以不能用于NHS酯交聯(lián)反應(yīng)的溶液配制，但是可以用于NHS酯交聯(lián)反應(yīng)的中止。通常，中性至堿性條件下的NHS酯交聯(lián)反應(yīng)都可以在反應(yīng)結(jié)束時通過添加過量的Tris堿來停止反應(yīng)。甘氨酸由于含有伯氨基所以也同樣可以用于反應(yīng)的中止。NHS酯交聯(lián)反應(yīng)的條件通常為4℃或室溫下，pH7-9，反應(yīng)30min至2h。4℃反應(yīng)條件下需要適當(dāng)延長時間才能達(dá)到室溫下的反應(yīng)效率，一般延長至4倍時間左右。NHS酯的用量是2-50倍過量于蛋白的量，具體的用量還需要根據(jù)蛋白溶液的濃度來確定。NHS酯的反應(yīng)濃度通常會在0.1-10mmol/L之間變動。蛋白溶液的濃度需要超過10μmmol/L，最后是在50-10μmmol/L之間，這樣才能避免交聯(lián)劑的水解反應(yīng)。

NHS酯可以分為水溶性和水不溶性兩類。水溶性NHS酯在N-羥基琥珀酰亞胺環(huán)上帶有磺酸基，這適用于不能耐受有機(jī)溶劑的交聯(lián)反應(yīng)。硫酸化NHS酯通常在純水相中反應(yīng)，并且當(dāng)溶液中存在DMSO時溶解度會顯著降低。水溶性NHS酯主要用于細(xì)胞表面的分子交聯(lián)反應(yīng)，因?yàn)樗鼈儾荒芡ㄍ讣?xì)胞膜。硫酸化NHS酯以鈉鹽形式出售，有效濃度大于10mmol/L。水不溶性 NHS酯的溶解度會根據(jù)溶液的組成成分而變化。最初，該類交聯(lián)劑主要溶解于可與水相混溶的有機(jī)溶液中，如DM-SO、DMF等。水不溶性NHS酯不帶電荷所以可以通透細(xì)胞膜。通常，有機(jī)溶劑的濃度為0.5%-10%。NHS酯的交聯(lián)反應(yīng)可能會造成蛋白活性的喪失，這是因?yàn)閰⑴c反應(yīng)的伯氨基可能位于蛋白的活性中心，或是對蛋白的活性是至關(guān)重要的。

（三）馬來酰亞胺類
巰基作為備選的交聯(lián)基團(tuán)具有以下優(yōu)點(diǎn)：交聯(lián)位點(diǎn)確定，交聯(lián)反應(yīng)可逆，可以實(shí)現(xiàn)順序交聯(lián)反應(yīng)。馬來酰亞胺可在 pH6.5-7.5的條件下與巰基發(fā)生特異性反應(yīng)形成穩(wěn)定的巰醚鍵。中性 pH值條件下，馬來酰亞胺與巰基反應(yīng)的速率快于氨基1000倍。但是pH大于8.5時，反應(yīng)更傾向于氨基。馬來酰亞胺不與酪氨酸、組氨酸和甲硫氨酸發(fā)生反應(yīng)。馬來酰亞胺在溶液中也會發(fā)生水解反應(yīng)，尤其是在pH值大于8.0的條件下。水解反應(yīng)會與巰基交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生競爭。反應(yīng)溶液中應(yīng)該避免自由巰基的存在。同樣，巰基化合物也可用于馬來酰亞胺交聯(lián)反應(yīng)的終止。反應(yīng)緩沖體系中添加 EDTA可以避免巰基的氧化。


（四）鹵乙酰基類
最為常用的α-鹵乙?；惤宦?lián)劑含有可以在生理pH值條件下與巰基反應(yīng)的鹵乙?；鶊F(tuán)。為保證巰基反應(yīng)的特異性，通常選擇pH8.5條件，并且鹵乙?；宦?lián)劑輕微過量。鹵乙?；宦?lián)劑大量過量會與其他氨基酸發(fā)生非特異性反應(yīng)。咪唑可以與鹵乙酰基類在pH6.9-7.0條件下發(fā)生反應(yīng)，但是反應(yīng)孵育時間必須超過一周。為抑制游離碘的生成，鹵乙?；宦?lián)反應(yīng)應(yīng)該閉光進(jìn)行，因?yàn)橛坞x鹵素可以與酪氨酸、組氨酸和色氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)。常用的NHS酯鹵乙?；p官能團(tuán)交聯(lián)劑包括SIA、SIAB和硫化SIAB等。


（五）二硫代聯(lián)吡啶
二硫代聯(lián)吡啶可與巰基在較寬pH值范圍內(nèi)發(fā)生反應(yīng)形成二硫鍵，最佳pH值為4-5。由于反應(yīng)后產(chǎn)生2-硫吡啶，因此可以通過檢測其在343nm的吸光度值判斷反應(yīng)進(jìn)行的程度。常用的二硫代聯(lián)吡啶類交聯(lián)劑包括LC-SPDP、硫化LC-SPDP和PDPH。


（六）酰肼類
羰基化合物（醛酮類）可與酰肼和氨基在pH5-7的條件下反應(yīng)，與酰肼的反應(yīng)速度快于氨基。此類交聯(lián)劑可以用于位點(diǎn)特異性的交聯(lián)反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中所含有的羰基并不是十分穩(wěn)定，但是多糖鏈經(jīng)高碘酸鈉輕度氧化后會經(jīng)鄰近的羥基氧化成為醛基或酮基。通常此類氧化反應(yīng)都是在閉光0-4℃條件下進(jìn)行的，以此避免副反應(yīng)的發(fā)生。隨后添加酰肼就可以形成腙鍵。此種交聯(lián)反應(yīng)主要用于抗體的修飾方面，因?yàn)榭贵w的Fc段通常含有碳水化合物。0℃，1mmol/L高碘酸鈉條件下，氧化反應(yīng)僅限于唾液酸殘基。如果濃度提高到6~10mmol/L水平，那么蛋白分子中的其他碳水化合物也可以參與反應(yīng)。


（七）碳二亞酰胺類
碳二亞酰胺可以介導(dǎo)羧基與氨基或酰肼的反應(yīng)，生成酰胺鍵或腙鍵。由于蛋白的末端及側(cè)鏈通常都含有羧基和氨基，所以使用此類交聯(lián)劑會造成蛋白多聚體的形成。所形成的共價鍵類似于蛋白分子的肽鍵，所以是十分穩(wěn)定的，如果不破壞蛋白是不可能打開形成的交聯(lián)鍵的。

EDC〔1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基） -碳二亞胺〕是此類交聯(lián)劑中使用最為廣泛的一種，在半抗原的合成和酶的修飾中使用較多。其機(jī)制一般認(rèn)為是蛋白殘基的羧基先同EDC反應(yīng)，生成活潑的中間產(chǎn)物O-?；愲澹∣-acylisourea），這個中間產(chǎn)物再與親核基團(tuán)，如氨基或羥基，發(fā)生反應(yīng)。EDC本身在水中也很容易發(fā)生水解而失效。另外，pH值過高會使EDC及EDC與羧基反應(yīng)的活化中間物的水解趨勢增大。因此，EDC活化羧基最好是在酸性條件下進(jìn)行。實(shí)際操作中，每次加入EDC前后，都要調(diào)節(jié)pH值在3耀5的范圍內(nèi)。MES〔2-（嗎啉代） -乙烷磺酸〕是適用于碳二亞酰胺交聯(lián)劑的緩沖鹽。磷酸鹽緩沖體系會降低EDC的反應(yīng)效率，但增加EDC的量可以彌補(bǔ)交聯(lián)效率的降低。Tris堿、甘氨酸和乙酸緩沖體系不能用于EDC的交聯(lián)反應(yīng)體系。NHS及硫化NHS常添加于EDC的反應(yīng)體系中以增加交聯(lián)效率。EDC和NHS聯(lián)合使用活化羧基，最后可以得到NHS活化的特定位點(diǎn)。這樣形成的NHS酯O-酰基異脲中間體不僅同樣保留了對氨基的反應(yīng)性，并且提高了中間體的穩(wěn)定性。O-酰基異脲本身在酸性或是中性條件下半衰期只有幾秒。但是，NHS酯活化后，半衰期最多可以延長至幾小時，當(dāng)然這還受到溫度、pH值和交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)的影響。

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