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定量蛋白質組學在過去十年中取得了長足的進步，成為生物和生物醫(yī)學研究的重要工具。然而，由于蛋白質組的復雜性，穩(wěn)健的蛋白質組范圍測量仍然具有挑戰(zhàn)性。值得注意的是，蛋白質組的動態(tài)范圍很廣，細胞蛋白質組跨越 7 個數(shù)量級，而一些生物流體（如血漿）跨越 10 個數(shù)量級。此外，隨著該領域擴展到包括單細胞測量，超高靈敏度比以往任何時候都更加重要。盡管技術取得了進步，但在整個動態(tài)范圍內的定量靈敏度、準確度和精密度仍有改進的空間。雖然經常研究大量表征良好的蛋白質，但對許多低豐度蛋白質知之甚少。 因此，質譜 （MS） 已成為全蛋白質組定量測量的主要方法; 然而，進一步推進該領域需要不斷改進硬件和數(shù)據采集技術。

MS 為全面的蛋白質組范圍研究提供了前景，但在整個動態(tài)范圍內準確定量蛋白質仍然是一個尚未解決的挑戰(zhàn)。最近的研究報道了可檢測到大量蛋白質：在 44 分鐘的運行中檢測到多達 7700 個蛋白質，在單次 120 分鐘的運行中檢測到 10,000 個蛋白質， 以及使用生化分級分離的超過 12,000 個蛋白質。 這些結果突出了測量低豐度蛋白質的難度越來越大。此外，這些研究各自實施了自己的錯誤發(fā)現(xiàn)率和可量化峰值閾值，因此很難比較這些結果。即使是 1% 的標準錯誤發(fā)現(xiàn)率 （FDR） 在不同的工具、工具和數(shù)據集中也可能具有截然不同的含義。不產生任何定量信息的測量會夸大數(shù)字，同時稀釋統(tǒng)計功效。然而，許多蛋白質組學研究認為定量是理所當然的，很少有實驗在顯著的動態(tài)范圍內對定量進行基準測試。因此，對新技術進行嚴格的分析評估，主要關注其定量能力，是技術開發(fā)周期的關鍵部分。

使用膜結合顆粒富集方法，我們使用 Orbitrap Astral 質譜儀在單次 70 分鐘 LC-MS 運行中定量了 5163 種蛋白質。此處描述的基準測試展示了 Astral 質量分析儀在穩(wěn)定定量 DIA 方面的強大功能。

為了評估 Orbitrap Astral MS 產生新的生物學見解的潛力，我們測試了它在血漿上的性能，血漿基質既常見又具有分析挑戰(zhàn)性。 雖然分級分離和富集策略提高了血漿蛋白質組的覆蓋率，納米顆粒分級分離在 5 次運行中檢測 1500-2000 個蛋白質，而其他方法在一次運行中可檢測多達 2700 個蛋白質 ，但血漿蛋白質組仍然是一個艱巨的分析挑戰(zhàn)。解決動態(tài)范圍問題的兩種主要方法是增加質譜儀本身的動態(tài)范圍，或者使用富集或去除策略來減小我們正在測量的樣品的動態(tài)范圍。在這里，我們通過使用高靈敏度的 Orbitrap Astral MS 來測量細胞外囊泡富集樣品中的血漿蛋白，從而應用這兩種策略。

為了減小動態(tài)范圍，我們使用了一種簡單的基于磁珠的方案，該方案能夠從血漿中富集細胞外囊泡 （EV）。由于大多數(shù)豐度血漿蛋白與囊泡無關或位于囊泡內，因此它們在 EV 富集過程中被耗盡。使用 MagStart高孔聚合物基質的組合富集 EV，該基質用作膜結合顆粒的分子“網”。磁珠的聚合物基質包含季銨鹽表面化學成分，產生陽離子電荷（MagStart-SAX 磁珠）。多孔聚合物允許囊泡和生物分子嵌入珠子的體積內，正電荷提供了一種根據電荷區(qū)分囊泡和脂蛋白顆粒的方法。該方案導致已知 EV 標志物的富集約 20 倍，常見血漿蛋白的消耗約 95%。使用該方案，Wu 等人能夠將總血漿中的 1088 個蛋白質檢測（使用血漿 EV 生成的文庫）提高到富集血漿中的 4163 個。

為了評估基于 Astral 的儀器中的血漿蛋白質組覆蓋率，我們評估了在富含 EV 的血漿和總血漿中具有短 （30 分鐘） 和長 （60 分鐘） 梯度的多種采集方法的定量性能。我們對每個梯度使用了多個隔離窗口大小和進樣時間來評估這些參數(shù)的優(yōu)點。對于 30 分鐘梯度，我們在 187 Hz（最大進樣時間 3.5 ms，第 2 個隔離窗口）、90 Hz（最大進樣時間 10 ms，第 4 個隔離窗口）和 50 Hz（最大進樣時間 20 ms，第 4 個動態(tài) DIA 窗口）下操作儀器。對于 60 分鐘的梯度，我們測試了兩種方法，均在 60 Hz（最大注射時間 15 ms）下運行，一種使用 4 Th 靜態(tài)隔離窗口，另一種使用 2 Th 動態(tài)隔離窗口。

不出所料，我們發(fā)現(xiàn)較長的梯度比較短的梯度產生更多的肽和蛋白質水平鑒定。60 min 梯度、4 Th分離窗口和 15 ms 最長進樣時間產生了最多的肽和蛋白質水平檢測結果，從 5163 個蛋白質中獲得了 44,668 個肽。使用 30 min 梯度和 4 Th 分離窗口和 10 ms 的最大進樣時間，我們從 4704 種蛋白質中檢測到 37,534 種肽。通常，減慢采集速度以允許更長的進樣時間可以提高技術精度，盡管縮短 dDIA 的質量范圍會減少肽和蛋白質檢測的數(shù)量。這里評估的所有方法都檢測到了 4200 多種蛋白質，具有很高的技術精度，這表明 Astral 非常適合這些類型的測量。此外，Astral 能夠檢測某些標記蛋白的富集和耗竭，這些標記蛋白相對于總血漿跨越較寬的動態(tài)范圍）。 使用相同的富集方案，Wu 等人在 Thermo Scientific Orbitrap Eclipse MS 上以 110 分鐘的梯度檢測到來自 4163 種蛋白質的 37,942 種肽。 Orbitrap Astral MS 能夠在 30 分鐘的梯度中檢測更多的蛋白質和相似數(shù)量的肽，這突出表明 Astral 分析儀提高速度和靈敏度的一個好處是能夠在保持甚至增加覆蓋率的同時提高通量。

雖然技術精度和與已知生物學的一致性表明 Orbitrap Astral MS 產生的測量結果有意義，但很明顯，這些檢測中有一定比例可歸因于背景信號和化學噪聲。因此，為了確定高質量肽和蛋白質的比例，我們過濾了至少具有三個共洗脫通道的肽的結果。應用該過濾器后，肽和蛋白質的數(shù)量僅略微減少，使用 dDIA 方法從 4453 個蛋白質中達到最大值 31,373 個肽。過濾具有多個協(xié)變通道的肽的一個結果是消除了具有化學干擾的肽，從而提高了變異系數(shù)。在這里，增加進樣時間可以改善離子統(tǒng)計數(shù)據，從而提高靈敏度和精密度。同樣，縮小隔離窗口可以提高測量選擇性并減少化學干擾。增加的進樣時間和提高的選擇性都導致了檢測限的提高。即使使用相對嚴格的質量過濾器，這里介紹的血漿蛋白質組覆蓋率也是前所未有的。