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1988年，澳大利亞兩位科學(xué)家Donald B. Smith和Kevin S. Johnson首次提出谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-Transferase, GST）親和標(biāo)簽的概念，并成功從細(xì)菌中一步純化出高純度GST融合蛋白。此后，目的蛋白融合GST標(biāo)簽后進(jìn)行親和純化被廣泛使用，至今仍是純化重組蛋白常用的方法，由此衍生的GST Pull-down技術(shù)同樣是蛋白互作研究重要手段之一。

一. Pull-down技術(shù)原理

Pull-down是指利用生物素、His或者GST等標(biāo)簽與已知蛋白融合表達(dá)作為誘餌蛋白，隨后將誘餌蛋白純化或固定在與其親和的固相支持物上（磁珠），與蛋白樣本或者包含蛋白樣本的裂解液共孵育，進(jìn)而捕獲能夠與誘餌蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，最終通過洗滌、洗脫、WB檢測或者質(zhì)譜分析等手段獲得與誘餌蛋白存在相互作用的蛋白的一種方法。按照標(biāo)簽類型可分為GST Pull-down、His Pull-down、生物素-Pull-down等。

GST Pull-down技術(shù)即是基于Pull-down的原理，將已知蛋白與GST標(biāo)簽融合表達(dá)純化并固定在含谷胱甘肽（GSH）的瓊脂糖珠上（磁珠購買請參考http://www.5000js.com/Product/3249714524.html），形成已知蛋白-GST-GSH-瓊脂糖珠復(fù)合體，隨后與蛋白樣本共孵育，捕獲與已知蛋白相互作用蛋白并進(jìn)行Western blot檢測或者質(zhì)譜鑒定。

圖GST Pull-down原理示意圖

二. Pull-down技術(shù)特點

1、技術(shù)優(yōu)勢

• 直接驗證蛋白相互作用，證據(jù)扎實；

• 蛋白標(biāo)簽與固相支持物親和力強(qiáng)，洗脫純度高；

• 無需抗體，親和作用結(jié)合，富集效果好；

2、技術(shù)缺陷

• 需將蛋白通過原核表達(dá)系統(tǒng)純化出來，增加實驗難度；

• 體外驗證互作，無法反映體內(nèi)真實互作狀態(tài)；

• 無法檢測間接相互作用或者弱相互作用；

• 部分標(biāo)簽較大，可能影響蛋白構(gòu)象，造成假陰性；

• 蛋白可能因強(qiáng)電荷作用結(jié)合，造成假陽性；

三. Pull-down常用標(biāo)簽

通常能用于蛋白純化的標(biāo)簽都可用于Pull-down實驗，一般常用蛋白純化標(biāo)簽如GST、His、MBP、SUMO以及生物素等，具體特點如下：

（1）GST標(biāo)簽：大小為26 kDa，使用GSH親和純化，廣泛應(yīng)用于各種融合蛋 白表達(dá)，能夠形成高度可溶的蛋白，且在大腸桿菌中能夠大量表達(dá)，但分子量較大，可能影響蛋白構(gòu)象；

（2）His標(biāo)簽：大小為0.84 kDa，使用Ni柱純化，在非離子型表面活性劑存在 或者變性條件下純化，能夠純化包涵體蛋白，純化條件相對溫和；

（3）Flag標(biāo)簽：大小1.01 kDa，可直接通過FLAG親和層析進(jìn)行非變性純化， 純化效率高，并且在真核表達(dá)系統(tǒng)中效率高；

（4）MBP標(biāo)簽：大小為40 kDa，全稱為麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽，使用MBP結(jié)合 基質(zhì)（丙糖醛酸瓊脂糖樹脂，amylose resin）進(jìn)行純化，能夠減少目的蛋白降解，增加蛋白表達(dá)量和穩(wěn)定性，MBP序列N端含有信號肽，適用于毒性蛋白純化，但標(biāo)簽較大，可能影響目的蛋白空間構(gòu)象；

（5）SUMO標(biāo)簽：大小11.5 kDa，是小分子泛素相關(guān)修飾蛋白，能夠促進(jìn)蛋白正確折疊，并且具有耐熱和耐蛋白酶特性，能夠保持純化蛋白的穩(wěn)定性；

（6）NusA標(biāo)簽：大小為54.9 kDa，不具備獨立的純化標(biāo)簽，需與His等標(biāo)簽聯(lián)用后親和純化，能夠極大提高蛋白可溶性，但可能影響蛋白空間構(gòu)象；

（7）生物素（Strep）標(biāo)簽：大小為1.06 kDa，可用生物素親和純化，偏好真核表達(dá)系統(tǒng)，目的蛋白純度高；

四. Pull-down技術(shù)流程

1、融合蛋白小量表達(dá)測試（以GST Pull-down為例）

（1）選擇GST純化標(biāo)簽和適當(dāng)表達(dá)載體并構(gòu)建GST-蛋白A表達(dá)質(zhì)粒；

（2）將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞如大腸桿菌BL21中，培養(yǎng)至適當(dāng)密度（OD = 0.6-0.8）后，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行蛋白表達(dá)誘導(dǎo)；

注意：IPTG濃度一般設(shè)置在0.3-1.0 mM之間；IPTG誘導(dǎo)溫度通常設(shè)置常溫（28 ℃）和低溫（16 ℃）兩組；IPTG誘導(dǎo)時間設(shè)置4-18 h之間；

（3）分別設(shè)置不同IPTG使用濃度、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時間進(jìn)行蛋白表達(dá)誘導(dǎo)；

（4）蛋白表達(dá)誘導(dǎo)完成后，分別收集不同條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體，加入PBS后超聲破碎，收集上清；

（5）加入Loading Buffer煮樣后Western blot檢測GST-蛋白A表達(dá)效果；

圖 蛋白表達(dá)結(jié)果示意圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

2、蛋白大量表達(dá)純化

（1）根據(jù)小量表達(dá)測試結(jié)果，選擇最適宜的IPTG使用濃度、誘導(dǎo)溫度和時間，進(jìn)行GST-蛋白A大量表達(dá)誘導(dǎo)；

（2）誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體加入PBS后進(jìn)行超聲破碎，收集上清；

（3）使用GST純化柱對到蛋白進(jìn)行純化獲得GST-蛋白A；

（4）取適量純化后的蛋白，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色檢測蛋白純度和濃度；

圖 蛋白純化結(jié)果示意圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

3、Pull-down實驗

若互作蛋白B同樣通過蛋白表達(dá)純化，可直接按照步驟（4）進(jìn)行Pull-down實驗；若互作蛋白B未通過蛋白表達(dá)純化或互作蛋白未知，則需按照步驟（1）-（3）準(zhǔn)備互作蛋白樣本。

（1）培養(yǎng)并處理細(xì)胞（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、藥物處理等）；

（2）選擇適當(dāng)細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑）對細(xì)胞進(jìn)行裂解；

（3）離心，去除細(xì)胞碎片，收集上清；

（4）將制備好的GST-蛋白A固定到GSH-瓊脂糖磁珠上（磁珠購買請參考http://www.5000js.com/Product/3249714524.html），形成beads-GSH-GST-蛋白A復(fù)合體；

（5）將蛋白B或者細(xì)胞裂解液與beads-GSH-GST-蛋白A復(fù)合體共孵育，形成beads-GSH-GST-蛋白A-蛋白B復(fù)合體；

注意：通常設(shè)置beads-瓊脂糖磁珠與裂解液共孵育作為陰性對照組；

（6）洗滌去除非特異性結(jié)合蛋白；

（7）利用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白并收集目的蛋白；

（8）Western blot檢測已知蛋白B或者質(zhì)譜分析未知蛋白；

圖 GST Pull-down實驗流程示意圖

1、已知蛋白互作驗證

對于已知蛋白是否存在相互作用，通常利用Western blot進(jìn)行檢測，設(shè)置GST+His-B組作為陰性對照；Input用于蛋白表達(dá)檢測，Pull-down分析互作結(jié)果分析。

上圖為檢測蛋白A和蛋白B是否互作結(jié)果。結(jié)果顯示，Input和Pull-down中，GAPDH皆正常檢出，表明細(xì)胞樣本蛋白提取正常（若蛋白B也為純化蛋白，則無需檢測GAPDH表達(dá)）；Input和Pull-down中，GST+His-B組中僅檢出GST目的條帶，GST-A+His-B組中僅檢出GST-A目的條帶，表明GST-A蛋白純化正常且無非特異性條帶；

左圖中，Input正常檢出His-B目的條帶，表明蛋白B表達(dá)正常；Pull-down中GST+His-B組未檢出條帶，表明GST不與His-B發(fā)生結(jié)合；GST-A+His-B組檢出His-B蛋白，表明GST-A可富集His-B，蛋白A和蛋白B存在互作；右圖中，GST-A+His-B組未檢出His-B蛋白，表明GST-A無法富集His-B，蛋白A和蛋白B不存在相互作用。

2、未知互作蛋白篩選

對于篩選與目的蛋白存在相互作用的潛在蛋白，通常利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分析。首先利用Western blot技術(shù)對Pull down結(jié)果進(jìn)行檢測，Western blot檢測包含Input組、GST組以及Pull-down組，其中Input組和GST組分別作為陽性對照和陰性對照，Pull-down則用于檢測GST-A是否正常存在；質(zhì)譜分析時可將GST樣本作為陰性對照，排除假陽性信號。

七. Pull-down影響因素

      在Pull-down實驗過程中，蛋白表達(dá)、純化、Pull-down實驗各個過程出現(xiàn)問題都會影響最終Pull-down結(jié)果，主要影響因素如下：

1、融合蛋白標(biāo)簽選擇

不同蛋白標(biāo)簽大小差別較大，部分大分子量標(biāo)簽如GST、MBP以及NusA等可能會影響蛋白的正確折疊或者蛋白表達(dá)，因此可在實驗前利用生物信息學(xué)預(yù)測標(biāo)簽是否影響蛋白構(gòu)象或者采用X-射線晶體分析等手段加以驗證，保證實驗結(jié)果更加可信。

2、蛋白表達(dá)載體的選擇

不同蛋白表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒載體對于融合蛋白可溶性、蛋白表達(dá)誘導(dǎo)方式以及表達(dá)豐度存在差異，因此在進(jìn)行蛋白表達(dá)純化時需選擇合適的表達(dá)質(zhì)粒，確保融合蛋白能夠大量表達(dá)可溶性蛋白。例如pGEX載體通常用于GST融合蛋白表達(dá)。目前常用蛋白表達(dá)載體如下：

（1）pET系列：T7啟動子，使用His標(biāo)簽，便于蛋白純化，并且蛋白表達(dá)量 高，但容易形成包涵體；

（2）pGEX系列：Tac啟動子，使用GST標(biāo)簽，表達(dá)量高，促溶效果好，是目 前使用較為廣泛的表達(dá)載體，但GST標(biāo)簽較大，可能影響蛋白構(gòu)象；

（3）pMAL系列：Tac啟動子，使用MBP標(biāo)簽，促溶效果極強(qiáng)，但MBP標(biāo)簽 大，容易影響蛋白構(gòu)象；

（4）pCold系列：CSPA啟動子，帶有低溫誘導(dǎo)原件，通常適用于溫度敏感蛋 白，蛋白表達(dá)量較低。

3、蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件

（1）誘導(dǎo)溫度

由于蛋白間存在較強(qiáng)的溫度依賴性疏水作用，溫度過高導(dǎo)致蛋白聚集并沉淀，容易形成包涵體。因此大部分蛋白表達(dá)表達(dá)需低溫誘導(dǎo)（16℃）；但部分溫度敏感型表達(dá)載體如pBV220則需要較高溫度進(jìn)行（30℃）蛋白表達(dá)誘導(dǎo)。因此在進(jìn)行小量蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時可設(shè)置高溫組和低溫度進(jìn)行檢測，選擇適合的誘導(dǎo)溫度。

（2）誘導(dǎo)時間

蛋白表達(dá)過程中，通常選擇在菌體處于對數(shù)生長期（OD值一般為0.6-0.8）進(jìn)行蛋白表達(dá)誘導(dǎo)。由于菌體此時生長速度快，因此可獲得大量可溶性蛋白。通常而言，誘導(dǎo)時間與誘導(dǎo)溫度成反比，誘導(dǎo)溫度越高，誘導(dǎo)時間越短；若為低溫誘導(dǎo)，則需相應(yīng)延長表達(dá)誘導(dǎo)時間。在進(jìn)行小量蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時可設(shè)置不同誘導(dǎo)時間梯度，選擇適合的蛋白高表達(dá)誘導(dǎo)時間。

（3）誘導(dǎo)劑濃度

不同的蛋白表達(dá)載體需選擇不同誘導(dǎo)劑。以GST Pull-down實驗為例，目前常用表達(dá)載體為pGEX系列，所用誘導(dǎo)劑為IPTG。雖然IPTG不會被細(xì)菌代謝而保持穩(wěn)定的濃度，但由于具有一定的細(xì)胞毒性，因此濃度過高會導(dǎo)致菌體活性差甚至死亡，進(jìn)而影響蛋白表達(dá)和純化，例如產(chǎn)生大量錯誤折疊蛋白并形成包涵體。因此在實驗中通常設(shè)置不同濃度梯度，并且盡量選擇低濃度、長時間誘導(dǎo)表達(dá)的方式，以獲取足夠量的可溶性融合蛋白。常用蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑如下：

• IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：最常用的誘導(dǎo)劑之一，通常用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，主要通過與lac操縱子結(jié)合，解除阻遏蛋白對啟動子的抑制，啟動目的蛋白表達(dá)。

• 乳糖/乳糖類似物：與IPTG類似，在天然的lac系統(tǒng)中，乳糖或者其類似物可以通過與lac操縱子結(jié)合誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。此類誘導(dǎo)劑通常適用于更加溫和或者更加自然條件下的蛋白表達(dá)。

• 抗生素：針對特定系統(tǒng)并選擇特定抗生素，如Tet-on/Tet-off系統(tǒng)選擇四環(huán)素或其衍生物，能夠通過與相應(yīng)調(diào)控元件結(jié)合誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，此類誘導(dǎo)劑通過特定濃度抗生素啟動或者關(guān)閉蛋白表達(dá)。

• 金屬離子：與抗生素誘導(dǎo)類似，某些金屬相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)中，如T7噬菌體啟動子系統(tǒng)結(jié)合金屬離子（Zn²⁺）能夠誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，此類誘導(dǎo)劑使用濃度需根據(jù)載體和細(xì)胞系的敏感性進(jìn)行確定。

4、包涵體形成

在蛋白表達(dá)過程中，由于蛋白錯誤折疊并聚集形成包涵體時，導(dǎo)致Pull-down實驗失敗。可通過使用高濃度的尿酸和鹽酸胍使其變性解聚，隨后逐步去除變性劑并加入適當(dāng)?shù)木彌_液使蛋白重新折疊，恢復(fù)功能性構(gòu)象，進(jìn)行后續(xù)的pull-down實驗。也可通過降低誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度、引入分子伴侶共表達(dá)、換專用感受態(tài)等方式來解決。

5、核酸分子影響

對于RNA結(jié)合蛋白或者DNA結(jié)合蛋白，在存在核酸的情況下，會通過與核酸結(jié)合造成假陽性，因此在進(jìn)行Pull-down實驗時需要加入核酸酶，去除核酸造成的假陽性結(jié)果。

八. Pull-down常見問題

1、Pull-down結(jié)果出現(xiàn)背景信號

背景雜帶信號主要源于非特異性結(jié)合。在GST-A富集靶蛋白階段可通過增加洗脫次數(shù)、更強(qiáng)的洗脫條件、使用BSA等抑制非特異性結(jié)合過程；在Western blot實驗時，則需嚴(yán)格按照實驗流程，參考前文《蛋白互作檢測之磁珠法Co-IP技術(shù)》，使用更加合適的抗體等方法減少非特異性結(jié)合。

2、Pull-down蛋白條帶模糊

出現(xiàn)蛋白條帶模糊的原因包括蛋白純度不夠或者蛋白降解導(dǎo)致。針對前者可適當(dāng)增加蛋白洗脫過程中洗脫劑的濃度或者優(yōu)化蛋白純化方法如在Ni親和層析時使用高鹽buffer；更換表達(dá)菌體，進(jìn)行蛋白標(biāo)簽聯(lián)用等手段解決蛋白純度不夠問題；針對蛋白降解問題，如是因為蛋白序列或者密碼子偏好性等原因，則可換用Rosett、OrigamiB等菌體進(jìn)行蛋白表達(dá)。此外可在實驗中增加蛋白酶抑制劑的用量，保證實驗全程低溫進(jìn)行等。

3、Pull-down結(jié)果與其他手段結(jié)果不一致

由于Pull-down實驗屬于體外水平，僅能驗證直接相互作用，因此對于某些間接互作蛋白無法有效檢出，而Co-IP技術(shù)用于檢測體內(nèi)生理狀態(tài)下蛋白互作情況，可檢出間接互作蛋白。因此Pull-down結(jié)果可能存在與其他檢測結(jié)果不一致的情況，此時需增加檢測手段，進(jìn)行相互佐證并分析具體互作類型。

九. Pull-down技術(shù)案例

1、GST Pull-down證實PHB2調(diào)控SHIP2與PHB1和PHB2的互作

上圖Input結(jié)果顯示，內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)正常，tGFP-SHIP2表達(dá)正常，GST-PHB1和GST-PHB2表達(dá)正常；GST Pull-down結(jié)果顯示，使用GST-PHB1或者GST-PHB2蛋白均可拉下t-GFP-SHIP2，表明SHIP2蛋白與PHB1或者PHB2均存在相互作用。使用sh-PHB1干擾PHB1的表達(dá)，對GST Pull-down結(jié)果無影響，使用shPHB2干擾PHB2的表達(dá)時，GST-PHB1與tGFP-SHIP2的互作消失，GST-PHB2與tGFP-SHIP2的互作減弱，表明SHIP2與PHB1或者PHB2的互作依賴于PHB2的表達(dá)。

2、蛋白直接相互作用研究

上圖中，Co-IP結(jié)果顯示（左圖），在293T和TSCCA細(xì)胞中，利用PER2進(jìn)行IP富集后，可檢測到HSP90、IKKα、IKKβ目的蛋白，表明PER2蛋白與HSP90、IKKα、IKKβ蛋白形成復(fù)合體；GST Pull-down結(jié)果顯示（右圖），使用GST-PER2進(jìn)行富集后，金科檢測到HSP90目的蛋白，表明PER2僅與HSP90為直接互作，與IKKα、IKKβ蛋白為間接互作。