盡管傳統(tǒng)的填充床色譜法已經(jīng)很成熟，但它需要大量的補(bǔ)料澄清以防止色譜柱堵塞。3 此外，多孔結(jié)構(gòu)中的擴(kuò)散傳質(zhì)很慢，并且由于大型生物制藥模式的空間位阻，有效表面積減小。4

       與傳統(tǒng)的小分子相比，生物制劑更復(fù)雜、體積更大，這使得這兩個(gè)因素越來越受到限制。因此，替代分離技術(shù)對于克服這些瓶頸至關(guān)重要。此外，工藝強(qiáng)化為增強(qiáng)生物工藝提供了巨大的機(jī)會。工藝強(qiáng)化是集成工藝設(shè)計(jì)、新技術(shù)和設(shè)備的組合，通過減少生產(chǎn)時(shí)間、提高產(chǎn)品質(zhì)量和最大限度地減少資源使用來提高整體生產(chǎn)力。正如我們將在本文中演示的那樣，基于功能磁性顆粒的磁分離是一種非常有前途的工藝強(qiáng)化技術(shù)。

圖 1. 常規(guī)擴(kuò)散限制填充床色譜法和新型磁性分離原理的示意圖。這兩種技術(shù)都描述了使用基于蛋白 A 的配體純化 mAb。（A） 在常規(guī)色譜中，使用功能性樹脂的填充床，進(jìn)料流通過該填料床。相比之下，（C） 磁分離依賴于功能性磁性顆粒 （MP），這些磁性顆粒在進(jìn)料流中被攪動，并且可以磁性保留以進(jìn)行緩沖液交換。（B） 兩種技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)步驟包括將 mAb 與蛋白 A 配體結(jié)合、洗去雜質(zhì)、洗脫 mAb 和再生基質(zhì)。

1. 磁分離是一種新型下游工藝技術(shù)

       磁性分離依賴于磁性和非磁性材料的分離。傳統(tǒng)上，它已應(yīng)用于選礦、鋼鐵生產(chǎn)和廢水處理等領(lǐng)域，以分離具有本征磁化的物質(zhì)。5,6 此外，它在實(shí)驗(yàn)室的分析和診斷中得到了很好的應(yīng)用，部分是在自動化高通量平臺上。7 在過去的 10~15 年中，磁性分離技術(shù)在制備型生物分離中也越來越受歡迎（參見圖 1C）。8 因此，生物材料選擇性地與磁性顆粒 （MP） 結(jié)合，例如，磁性顆?？梢酝ㄟ^簡單且廉價(jià)的共沉淀反應(yīng)或天然來源產(chǎn)生。9 MP 的尺寸通常在 10 nm 至 100 μm 之間，由磁芯（例如氧化鐵）組成，可以像在色譜法中一樣使用特定應(yīng)用的化學(xué)或生化涂層（例如，功能性硅烷或基于糖類的生物聚合物）和/或生物親和配體（例如，蛋白質(zhì) A）進(jìn)行修飾。磁性分離通常遵循與色譜相同的步驟（上樣、洗滌、洗脫和顆粒再生，如圖 1B 所示）。

       然而，與色譜中的流通柱不同，MP 在其各自的進(jìn)料流/緩沖液中分散和攪拌，并且通過磁保留顆粒和更換液體來進(jìn)行緩沖液交換（參見圖 1C）。與標(biāo)準(zhǔn)色譜相比，分散顆粒吸附劑產(chǎn)生的一般無孔性帶來了兩個(gè)決定性的優(yōu)勢：增強(qiáng)大型物質(zhì)的傳質(zhì)和未澄清進(jìn)料的潛在處理。此外，MP 可能具有高靶標(biāo)結(jié)合載量，這對于高效處理非常重要。

2. 磁性分離在下游強(qiáng)化方面具有很大的潛力

每個(gè)磁選工藝通常由三個(gè)主要組件組成，可以相應(yīng)地進(jìn)行調(diào)整：

• 磁性粒子 /
• 其表面功能化，以及
• 磁分離裝置。

雖然由于生物制藥應(yīng)用的可用系統(tǒng)數(shù)量有限，分離機(jī)的選擇相對簡單，但進(jìn)料流和最終目標(biāo)會影響 MP 的選擇及其功能化。在下文中，將討論一些用例，它們?yōu)檫@三個(gè)組件提供了不同的選擇（圖 2）。

圖 2.簡化的示意圖，舉例說明了用于純化新型、mAb 和重組蛋白的選定已報(bào)道的磁性分離研究。MP 可以用特定的官能團(tuán)或配體修飾，以調(diào)節(jié)靶標(biāo)的結(jié)合特異性。磁性分離技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是可以集成澄清和捕獲步驟，這些步驟通常由昂貴且耗時(shí)的離心、過濾和色譜單元作執(zhí)行。

3. 單克隆抗體的純化

       mAb 生產(chǎn)中上游工藝 （USP） 的強(qiáng)化導(dǎo)致通過灌流和高細(xì)胞密度發(fā)酵方法顯著提高滴度。因此，DSP 現(xiàn)在面臨著處理兩種不同起始情況的挑戰(zhàn)。

• 小體積高滴度的高細(xì)胞密度肉湯（補(bǔ)料分批）或
• 體積大，mAb 滴度低，但無細(xì)胞（灌注）。

       離心和過濾作必須處理更高的細(xì)胞濃度，而色譜步驟必須處理極高的體積或高度濃縮的負(fù)載。這對傳統(tǒng)的純化方法構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)，并進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了 USP 和 DSP 之間更好地保持一致的必要性。

       磁分離為這兩個(gè)問題提供了潛在的解決方案。對于高細(xì)胞密度工藝，將離心、過濾和層析三個(gè)工藝步驟集成到一個(gè)分離步驟中可以解決高固體負(fù)荷的問題。相比之下，對于灌流培養(yǎng)，沒有固定相意味著吸附與體積無關(guān)，因此處理時(shí)間顯著縮短。

       磁性顆粒的獨(dú)特特性有助于集成，并打開了一個(gè)材料平臺，如果最終目標(biāo)需要，可以定制，但復(fù)雜性會增加。它們的高適應(yīng)性使色譜法中已知的傳統(tǒng)和創(chuàng)新的蛋白 A 配體能夠通過共價(jià)或非共價(jià)技術(shù)固定。隨后，可以將蛋白 A 功能化的 MP 直接添加到細(xì)胞液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。

       在這里，第二個(gè)有用的特性開始發(fā)揮作用：如前所述，與傳統(tǒng)色譜填料相比，它們的孔隙率降低或幾乎可以忽略不計(jì)?；诖斯ぷ髟硖岢隽藥讉€(gè)案例研究，盡管方法略有不同。

4. 澄清和捕獲的整合可產(chǎn)生高純度

       在實(shí)踐中，將蛋白 A 功能化的 MP 直接添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中。正如 Brechmann 等人使用蛋白 A 的瓊脂糖 MPs。10 所示，即使是高達(dá) 100 x 10⁶ 個(gè)細(xì)胞密度也不會對結(jié)合或洗脫行為產(chǎn)生不利影響。10, 11 純化約 16 L CHO 細(xì)胞培養(yǎng)物，滴度在 1.3~1.5 g^?1 IgG 之間， 花了 5 ~8 個(gè)小時(shí)。因此，顆粒上結(jié)合位點(diǎn)的飽和在孵育后 1 小時(shí)內(nèi)完成。通過集成處理，他們在洗脫液中實(shí)現(xiàn)了非常低的宿主細(xì)胞蛋白 （HCP） 水平 （< 5 ppm），他們將其歸因于溫和的處理，沒有明顯的細(xì)胞裂解11。

       Ebeler 等人使用德國 Andritz KMPT GmbH 的符合 GMP 標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)子-定子高梯度磁選機(jī) （RS-HGMS） 系統(tǒng) MES 100 RS 證明了從細(xì)胞培養(yǎng)物中直接捕獲 mAb。12 他們報(bào)告稱，每毫升應(yīng)用填料的工藝生產(chǎn)率是傳統(tǒng)色譜法的 3 倍，這凸顯了磁性分離技術(shù)的巨大潛力。

5. 缺點(diǎn)和瓶頸

       使用瓊脂糖包被 MP 的工藝可以與色譜工藝競爭，但受到其孔隙率導(dǎo)致的相當(dāng)緩慢的動力學(xué)的限制。開發(fā)低孔隙率的磁性介質(zhì)非常重要。為了解決這個(gè)問題，我們小組開發(fā)了一種基于非功能化和非多孔 MP 的替代顆粒方法（http://www.5000js.com/Product/Proteinextract/），具有肽標(biāo)簽促進(jìn)的親和配體固定。13 該方法無需耗時(shí)且昂貴的顆粒包被，減少了化學(xué)品消耗，并能夠在幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速的 IgG 相互作用。

       用于 mAb 分離的常規(guī) MP 的另一個(gè)缺點(diǎn)是需要酸性 pH 條件，這可能對 mAb 產(chǎn)品有害。我們通過將工程化鈣依賴性蛋白 A 配體共價(jià)偶聯(lián)到 GPTMS 功能化 14，該策略提供了由大部分無孔顆粒引起的更快動力學(xué)，并能夠在 pH 5.5 左右實(shí)現(xiàn)溫和的洗脫條件。

       然而，需要解決的主要挑戰(zhàn)是低濃度因子和缺乏合適的大型分離器系統(tǒng)。例如，假設(shè)每個(gè)循環(huán)處理 25 g mAb，則以 5 g ^-1 的 mAb 滴度（總共 10 kg）處理 2,000 L 生物反應(yīng)器的上清液，大約需要 400 次批次運(yùn)行。15 即使循環(huán)時(shí)間短至 1 到 2 小時(shí)，純粹的運(yùn)行次數(shù)也存在瓶頸，這主要是由于當(dāng)前磁選機(jī)的過濾能力有限。針對此問題，提出了兩種策略。

       首先，基于磁分離的工藝可以很好地整合，以至于可以跳過澄清和過濾步驟。這樣節(jié)省的時(shí)間可以補(bǔ)償一些高循環(huán)數(shù)。

       其次，開發(fā)顆粒容量為幾百克到幾千克的大型磁選機(jī)至關(guān)重要。首先，Andritz KMPT GmbH 提供了帶有 10 L 腔室的 RS-HGMS，理論上可以將循環(huán)次數(shù)減少到大約 40 次。正如 Tesanovic 等人最近所描述的，結(jié)合磁選機(jī)多尺度模型的開發(fā)，16 放大將變得更加直接。基于這些模型，腔室和矩陣設(shè)計(jì)可以進(jìn)行計(jì)算機(jī)優(yōu)化并相應(yīng)地進(jìn)行調(diào)整。還應(yīng)考慮到，隨著顆粒濃度的增加，洗脫可以產(chǎn)生更高的潛在產(chǎn)物濃度，因此實(shí)施額外的更小的洗脫室可能是有希望的，正如 Brechmann 等人所報(bào)告的那樣10。結(jié)合改進(jìn)的分離器設(shè)計(jì)，應(yīng)以連續(xù)或半連續(xù)處理為目標(biāo)，例如，通過分離器的串聯(lián)或磁力離心。半連續(xù)或完全連續(xù)處理可能會顯著提高生產(chǎn)率，就像傳統(tǒng)色譜一樣。17

6. 新模式的純化

       雖然 mAb 工藝受益于已建立的平臺，但基于病毒的治療、質(zhì)粒、基于 RNA 的療法和 CAR T 細(xì)胞療法等新模式仍處于開發(fā)的早期階段。純化這些分子的復(fù)雜性往往受到低生產(chǎn)率的阻礙，這推高了成本并延遲了市場準(zhǔn)備。18 這些新模式的工藝開發(fā)仍處于起步階段。這使得現(xiàn)在成為在工藝開發(fā)中實(shí)施磁性分離的理想時(shí)機(jī)，以便于以后在符合 GMP 的工藝中實(shí)施。

       Turco 等人使用 RS-HGMS （Andritz KMPT GmbH） 系統(tǒng)從粗HEK293T細(xì)胞裂解物中純化了重組腺相關(guān)病毒 （rAAV），其中 Mag Sepharose 微珠由 rAAV 特異性配體功能化。與基于色譜的處理相比，他們的工藝實(shí)現(xiàn)了 63% 的回收率，顯著減少了 HCP 和 DNA，同時(shí)將生產(chǎn)率提高了 10 倍。18

磁性分離是一種成熟的分析規(guī)模 DNA 純化方法。因此，它也被研究用于 mRNA 的大規(guī)模純化也就不足為奇了，尤其是關(guān)于基于 mRNA 的疫苗的潛力。

       在 3D 打印的一次性磁性分離室中使用用 oligo （dT） 功能化的磁珠，為生物制藥應(yīng)用提供了一種有趣的方法。19 雖然缺乏大規(guī)模實(shí)例，但正如 Harrer 等人最近提出的那樣，磁性分離可能有望用于 CAR T 細(xì)胞的純化。20 由于這些分子中的大多數(shù)需要輕柔處理，因此必須研究顆粒引起的物理應(yīng)力的影響。因此，目前尚不清楚開發(fā)的大型磁選機(jī)是否可以在不進(jìn)一步修改的情況下用于處理新模式。正如已經(jīng)描述的 mAb 工藝純化一樣，缺乏大型磁選機(jī)是進(jìn)一步生產(chǎn)規(guī)模工藝實(shí)施的瓶頸。

7. 重組蛋白的純化

       從微生物裂解物、發(fā)酵液或血清中純化生物制藥蛋白質(zhì)與上述用例不同，因?yàn)樗鼈兺ǔＩ婕暗蛢r(jià)分子。因此，沒有配體或官能團(tuán)化的簡單 MP 是降低成本的理想選擇。在這里，分離產(chǎn)量和純度可以通過正確選擇表面積與生物量比來調(diào)整。最后，它仍然是特異性和成本效益之間的賭博。

       當(dāng)使用非功能化 MP 時(shí)，與目標(biāo)蛋白質(zhì)融合的短親和肽標(biāo)簽可用于實(shí)現(xiàn)一定的特異性。其結(jié)果是一種基于成本極低、無毒 MP 的工藝，具有高結(jié)合載量，但與功能化 MP 相比特異性較低。21

       我們相信，它們用于用感興趣的細(xì)胞外產(chǎn)物從發(fā)酵液中原位去除產(chǎn)物的應(yīng)用具有巨大的潛力。帶有固定化金屬離子（如 Cu2+）的 MP 是特異性更高且材料成本仍然較低的不錯(cuò)選擇。22 這種方法結(jié)合了色譜中常用 （His）6-標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)和磁性分離的優(yōu)點(diǎn)。值得一提的是，色譜處理的專有技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于調(diào)整磁性分離，因?yàn)閮烧叨际腔谖降膯我蛔?。在這里，磁分離的研究和技術(shù)開發(fā)程度較低，但具有設(shè)計(jì)靈活性和無傳質(zhì)限制的優(yōu)勢。

       文獻(xiàn)中使用低成本或非功能化 MP 純化蛋白質(zhì)的大規(guī)模工藝揭示了與參比色譜工藝相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)量和純度。同樣，它們的主要優(yōu)點(diǎn)是顯著縮短了處理時(shí)間，尤其是在可以省略離心或過濾步驟的情況下。然而，與 mAb 加工相同的缺點(diǎn)仍然存在。缺少大規(guī)模裝置的方面是重組蛋白回收更加嚴(yán)重，因?yàn)檫@些分子通常以更高的體積生產(chǎn)，進(jìn)一步增加了使用目前市場上可用的小型裝置所需的循環(huán)次數(shù)。

8. 未來展望

       生物制藥生產(chǎn)非常嚴(yán)格，與傳統(tǒng)層析一樣，在狹窄的窗口內(nèi)需要微調(diào)和優(yōu)化的參數(shù)。因此，預(yù)計(jì)未來的改進(jìn)有限，真正的過程強(qiáng)化需要顛覆性技術(shù)——正如我們上面所展示的，磁分離技術(shù)具有巨大的潛力。然而，該技術(shù)需要進(jìn)一步發(fā)展，因?yàn)槭惺鄣呐糠蛛x器會嚴(yán)重限制吞吐量和可實(shí)現(xiàn)的濃縮因子。在我們看來，具有增強(qiáng)顆粒容量和（半）連續(xù)磁分離模式的分離器是提高通量和生產(chǎn)率的關(guān)鍵，因此應(yīng)該成為未來研發(fā)的重點(diǎn)。

       我們小組已經(jīng)致力于過程分析技術(shù) （PAT） 的實(shí)施和實(shí)時(shí)過程控制的建模方法的開發(fā)，這對連續(xù)應(yīng)用起決定性作用。16 此外，開發(fā)新型和更高效的功能性顆粒應(yīng)該是另一個(gè)研究重點(diǎn)，因?yàn)檫@些顆粒顯著影響磁分離過程的適用性和生產(chǎn)率。廈門普睿邁格生物科技有限公司（www.5000js.com）致力于各種功能的磁性納米顆粒的制備，并形成了豐富的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)和產(chǎn)品。通過自動集成 MP 合成及其在生物分離應(yīng)用中的應(yīng)用來高效生產(chǎn)這些顆粒，以降低成本并全面提高工藝生產(chǎn)率。最后，我們想解決生物制藥行業(yè)中的一次性設(shè)備趨勢，正如 Wommer 等人所展示的那樣，可以通過磁分離室中的一次性入口來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。在我們看來，磁分離技術(shù)的三個(gè)最具決定性的優(yōu)勢是

1. 由于顯著減少的傳質(zhì)限制和高結(jié)合載量，大量靶分子與磁性顆粒的快速相互作用，
2. 集成離心、過濾和澄清步驟的能力，可實(shí)現(xiàn)高水平的工藝集成，以及
3. 裸磁顆粒的成本效益高且簡單的大規(guī)模合成。

       然而，我們知道磁分離仍處于起步階段，新技術(shù)要在嚴(yán)格監(jiān)管的生物制藥行業(yè)中獲得認(rèn)可并與現(xiàn)有技術(shù)競爭是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。盡管如此，我們相信磁分離提供了一種有價(jià)值的方法，可以為提高整體生產(chǎn)率、增強(qiáng)可持續(xù)性、簡化加工和節(jié)省時(shí)間鋪平道路。

編者注：Galbusera 和 Zimmermann 的貢獻(xiàn)相同。

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