磷酸化蛋白組學(xué)樣本準(zhǔn)備指南
蛋白組學(xué)是生物研究的重要內(nèi)容，好的樣品就是實(shí)驗(yàn)成功的首要條件，那么樣品的收集以及預(yù)處理便是決定實(shí)驗(yàn)成敗的重要起點(diǎn)。下文總結(jié)了多年的樣品前處理經(jīng)驗(yàn)，下面給大家簡單介紹一下蛋白質(zhì)組學(xué)各類型樣品都是如何進(jìn)行收集與預(yù)處理的？
動物篇
常規(guī)組織
（心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、肌肉等）
PBS洗滌去除殘留血液和污染物，剔除無關(guān)的干擾組織（血管、脂肪、結(jié)締組織等）；
沖洗干凈，用組織剪或手術(shù)刀將組織分離成1cm3 左右的小塊；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
軟骨組織
PBS洗滌去除殘留血液和污染物；
用手術(shù)刀將軟骨切成1cm3 左右的小塊；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
軟體動物（吸蟲等）
PBS洗滌去除來自宿主的污染；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
動物毛發(fā)等
用適量2%SDS，50mM 磷酸鈉（pH7.8）緩沖液漂洗樣品，去除污染物，干燥；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
樣品量要求：
常規(guī)動物組織（心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、肌肉等）-定量蛋白組學(xué)>200mg；修飾蛋白組學(xué)>500mg
植物篇
大本植物莖、葉、花等
PBS清洗樣品表面泥土或明顯污染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
大本植物樹根、樹皮、樹枝等
PBS清洗樣品表面泥土或明顯污染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
草本植物、藻類、蕨類等
PBS清洗樣品表面泥土或明顯污染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
細(xì)小種子（如谷物等）
PBS清洗樣品表面泥土或明顯污染物，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
鮮果肉
切取鮮果肉，去皮切成 1cm3 左右小塊；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
花粉
植物開花期收集花粉，解剖顯微鏡下檢查花粉；
用解剖針去除花藥碎片等雜質(zhì)，轉(zhuǎn)入EP 管中，光學(xué)顯微鏡下檢查花粉的形態(tài)和純度；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
樣品量要求：
常規(guī)植物組織（幼嫩的根、葉、花、愈傷組織等）-定量蛋白組學(xué)>500mg；修飾蛋白組學(xué)>2g
微生物篇
細(xì)菌（菌體沉淀）
4℃，3000-5000×g離心10 min，收集菌體沉淀，棄上清；
用預(yù)冷的PBS小心重懸清洗沉淀3次，每次4 °C，3000-5000×g離心10 min，棄上清；
收集管底沉淀，液氮速凍5min，保存于-80℃。
真菌類（菌菇）
PBS 清洗，吸水紙吸去表面液體；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
樣品量要求：
菌體沉淀-定量蛋白組學(xué)>200mg；修飾蛋白組學(xué)>1g
細(xì)胞篇
懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中；
4℃，1000 ×g離心10 min收集細(xì)胞（1×107個(gè)細(xì)胞為宜），棄上清；
用預(yù)冷的PBS小心重懸清洗沉淀一次，1 ml PBS重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中；
1000 ×g離心10 min收集細(xì)胞，棄上清；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
用移液器吸除培養(yǎng)基；
加入滅菌PBS（若用移液槍加，則靠著培養(yǎng)皿壁加入，以免將細(xì)胞沖起），平放輕輕搖動1分鐘洗滌細(xì)胞，然后棄PBS；
用干凈的細(xì)胞刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿的一側(cè)（動作要快），將細(xì)胞盡量全部轉(zhuǎn)移至離心管中；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
樣品量要求：
懸浮/貼壁細(xì)胞-定量蛋白組學(xué)>1×107個(gè)細(xì)胞或體積>50ul細(xì)胞沉淀；修飾蛋白組學(xué)>1×108個(gè)細(xì)胞或體積>500ul細(xì)胞沉淀
體液篇
血漿
使用EDTA抗凝管采集血液；
輕輕地上下顛倒混勻 8-10 次；
4℃，1300-2000×g離心10 min，取上清；
用移液器將血漿轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白酶抑制劑，混勻，瞬時(shí)離心；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
血清
使用真空采血管收集血液；
輕輕地上下顛倒混勻5-6 次；
4℃，靜置30-60min，讓全血凝集；
4℃，1500-2000×g離心10min，取上清；
用移液器將上層淡黃色血清轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白酶抑制劑，混勻，瞬時(shí)離心；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
唾液
禁食兩小時(shí)以上，上午取樣；
1000g-2000g 離心5min，（或使用0.22um 濾膜過濾），取上清；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
腦脊液、關(guān)節(jié)液等體液
1000g-2000×g 離心5min，使用0.22μm 濾膜過濾，取上清；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
樣品量要求：
血漿/血清-定量蛋白組學(xué)>100ul；修飾蛋白組學(xué)>300ul
其他篇
血清/血漿-外泌體
用超速離心或其他方法提取外泌體，用電鏡觀察外泌體形態(tài)（推薦）；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
細(xì)胞上清-外泌體
細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%面積，去掉培養(yǎng)基，PBS洗三次；
換用無血清培養(yǎng)基生長一定時(shí)間（如24小時(shí)）后收集，4度300g離心10分鐘取出細(xì)胞，取上清；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
細(xì)胞上清
在收集前改用不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，即用不加血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
待細(xì)胞鋪滿80%左右，用移液槍吸取上清；
4℃，6000rpm離心5min，棄去底部可能出現(xiàn)的固體沉淀，取上清；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
發(fā)酵液
10000rpm-20000rpm 離心 30-60min，（或使用 0.22μm 濾膜過濾），取上清；
液氮速凍5min，保存于-80℃。
蛇、蝎毒液等（干重）
一般分為2種方法，可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇：
1)真空干燥（減壓干燥）：在低壓下，使蝎毒液中的水分快速蒸發(fā)的方法。蝎毒干燥后，應(yīng)緩緩旋開活塞，以防止空氣沖散。
蝎毒干粉。最后在凈化條件下取出干粉，立即分裝，密封低溫保存。
2)真空冷凍干燥：先將蝎毒液在低溫冰柜中預(yù)凍成固體，然后使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥和低溫保存。由于冷凍干燥是在低溫和高真空度下進(jìn)行的，所以毒液在凍干過程中不起泡，不粉不沾壁、疏松、易取出、易溶于水、有利于保存。
樣品量要求：
血清/血漿外泌體（需要的血清/血漿初始體積）-定量蛋白組學(xué)>1ml
細(xì)胞上清外泌體（需要的細(xì)胞上清初始體積）-定量蛋白組學(xué)>50ml
蛋白鑒定篇
膠條或泳道
膠條或者泳道皆可，建議考馬斯亮藍(lán)染色（條帶清晰，無降解）；
請用EP管裝好，不用加任何保存液，用冰袋寄送即可，顏色非常淺的條帶可取多個(gè)重復(fù)樣本放一起。
蛋白溶液
如果需要跑膠，建議加loading buffer去煮；
如果不跑膠，則不用添加loading buffer。
備注：蛋白溶液需注明溶液成分和蛋白大概濃度
磁珠樣本
不要加loading buffer 去煮，直接將連著磁珠的蛋白溶液用干冰寄送就好。
蛋白干粉
凍干的蛋白粉末裝入EP 管，低溫寄送
備注：以上修飾蛋白組學(xué)的樣本量僅限于磷酸化蛋白組學(xué)，關(guān)于乙?；鞍捉M學(xué)、泛素化蛋白組學(xué)、糖基化蛋白組學(xué)樣本量需具體分析。
- 上一篇：常用緩沖液配制計(jì)算器 2020/8/20
- 下一篇：客戶采用MagTransPoly進(jìn)行磁轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)——論文通訊 2020/7/26