免疫共沉淀技術用于探索可能的信號轉(zhuǎn)導機制
2019-4-6 11:33:39點擊：
在從事細胞信號轉(zhuǎn)導的研究過程中我們常常需要探尋新的通路。在縱橫交錯，紛繁復雜的cross-talk中如何篩選可能的路徑是signal transduction領域永恒的話題，而免疫共沉淀技術則是常用而簡便的方法之一。
1. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）技術是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。它能確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性的相互作用。
2. IP 利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合或細菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC 片段揭示待檢蛋白之間的相互關系。
以檢測某受體與JAK-STAT是否相關為例，實驗前需要提前預測Receptor X可能與JAKs中的哪一個結(jié)合（激活）。然后用X受體的抗體去拉復合物，再用JAK的抗體去進行WB檢測。如果兩種蛋白有相互作用，就會以復合物的形式存在于樣品中。需要了解的是，用A蛋白的抗體去沉淀A蛋白，這時候沉淀下來的可能是A蛋白，也可能是A和其他蛋白的復合體。然后用B蛋白的抗體去檢測沉淀下來的樣品（WB），如果檢測到B蛋白，就說明A蛋白和B蛋白是形成復合體的。具體的實驗中，可以把A當作受體把B當做JAK，也可以反過來。與此同時，也應該檢測受體激活的時候JAK-STAT是否同步激活，以及阻斷JAK-STAT以后受體的下游信號是否也被阻斷，這些都是證明可能存在的信號轉(zhuǎn)導的直接的證據(jù)。
3. 其優(yōu)點為：
（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；
（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；
（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。
4. 其缺點為：
（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；
（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；
（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。
5. 在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結(jié)果的真實性，應注意以下幾點：
（1）確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
（2）要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；
（3）確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。
1. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）技術是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。它能確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性的相互作用。
2. IP 利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合或細菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC 片段揭示待檢蛋白之間的相互關系。
以檢測某受體與JAK-STAT是否相關為例，實驗前需要提前預測Receptor X可能與JAKs中的哪一個結(jié)合（激活）。然后用X受體的抗體去拉復合物，再用JAK的抗體去進行WB檢測。如果兩種蛋白有相互作用，就會以復合物的形式存在于樣品中。需要了解的是，用A蛋白的抗體去沉淀A蛋白，這時候沉淀下來的可能是A蛋白，也可能是A和其他蛋白的復合體。然后用B蛋白的抗體去檢測沉淀下來的樣品（WB），如果檢測到B蛋白，就說明A蛋白和B蛋白是形成復合體的。具體的實驗中，可以把A當作受體把B當做JAK，也可以反過來。與此同時，也應該檢測受體激活的時候JAK-STAT是否同步激活，以及阻斷JAK-STAT以后受體的下游信號是否也被阻斷，這些都是證明可能存在的信號轉(zhuǎn)導的直接的證據(jù)。
3. 其優(yōu)點為：
（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；
（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；
（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。
4. 其缺點為：
（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；
（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；
（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。
5. 在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結(jié)果的真實性，應注意以下幾點：
（1）確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
（2）要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；
（3）確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。
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