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pull-down、免疫沉淀、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀、EMSA有什么差別?

2019-4-5 13:31:57點(diǎn)擊:


pull-down實(shí)驗(yàn):其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。

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免疫沉淀:(immunoprecipitation)是指利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,將抗原(常為靶蛋白)從混合體系沉淀下來,初步分離靶蛋白的一種方法。 

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免疫共沉淀(co-immunoprecipitation):是一種在體外探測兩個(gè)蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理是如果兩個(gè)蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話,那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí),另一個(gè)蛋白也會被同時(shí)沉淀下來。

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染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChIP):ChIP是一項(xiàng)比較流行的研究轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)與啟動子(promoter)相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過抗原抗體的特異性識別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。它能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白,是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法。 


凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA):通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時(shí),依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異), 和其它非相關(guān)的片段(非特異),來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。


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