質(zhì)譜指紋圖譜專家共識(shí) | 蛋白/多肽指紋圖譜在腫瘤中的臨床應(yīng)用專家共識(shí)（2024版）
摘要：隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，蛋白/多肽指紋圖譜在腫瘤診斷、治療選擇和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值日漸突出。本專家共識(shí)旨在全面梳理蛋白/多肽指紋圖譜的檢測分析方法和在腫瘤臨床領(lǐng)域中應(yīng)用的潛力，圍繞蛋白/多肽指紋圖譜的定義、臨床意義、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)分析方法，以及在腫瘤診斷、治療決策和復(fù)發(fā)監(jiān)測中的應(yīng)用，結(jié)合最新研究進(jìn)展，提出一系列關(guān)于蛋白/多肽指紋圖譜檢測和應(yīng)用的共識(shí)推薦，旨在提升醫(yī)療企業(yè)從業(yè)人員和臨床醫(yī)技人員對(duì)其的認(rèn)知水平，促進(jìn)蛋白/多肽指紋圖譜相關(guān)檢測產(chǎn)品的研發(fā)、轉(zhuǎn)化和在臨床腫瘤診療全流程中的應(yīng)用，從而為患者提供更為精準(zhǔn)的治療方案。
在現(xiàn)代腫瘤精準(zhǔn)檢測領(lǐng)域，蛋白/多肽指紋圖譜在腫瘤的診斷、治療決策和預(yù)后評(píng)估中扮演著越來越關(guān)鍵的角色。為了推動(dòng)蛋白/多肽指紋圖譜在腫瘤臨床管理中的應(yīng)用，提高醫(yī)療企業(yè)從業(yè)人員和臨床醫(yī)技人員對(duì)其重要性的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為蛋白/多肽指紋圖譜相關(guān)檢測產(chǎn)品的研發(fā)、轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)性建議，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性，基于最新的研究成果，本領(lǐng)域內(nèi)的專家學(xué)者共同編寫了本專家共識(shí)，系統(tǒng)性地介紹了蛋白/多肽指紋圖譜的基本概念、檢測分析技術(shù)及其在腫瘤診斷、治療決策、療效和預(yù)后評(píng)估中的作用，以促進(jìn)該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展，最終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化診療策略的優(yōu)化，為患者的精準(zhǔn)診療提供決策依據(jù)。根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，本專家共識(shí)將及時(shí)進(jìn)行修訂，以滿足腫瘤臨床應(yīng)用的需要。
1. 蛋白/多肽指紋圖譜概述
多肽通常指由2～100個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量200～10 000)[1]，主要由基因表達(dá)和蛋白代謝產(chǎn)生，如細(xì)胞因子、生長因子、激素和神經(jīng)肽等，包含基因表達(dá)信息、結(jié)構(gòu)蛋白和分泌蛋白信息及酶譜水平和活性信息等，處于中心法則下游，與表型關(guān)系更加密切[2]。目前研究顯示，多肽廣泛參與生物體內(nèi)的生理和病理過程。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，多肽也發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、蛋白-蛋白互作、酶活性、信號(hào)傳遞和細(xì)胞間通訊等多種機(jī)制影響腫瘤進(jìn)展[3]。基于多肽包含豐富的生物學(xué)信息、具有組織與疾病特異性和在腫瘤發(fā)生與發(fā)展全流程中的重要作用，腫瘤相關(guān)多肽引起研究者的廣泛興趣[1,4]。特異性的腫瘤相關(guān)多肽可在腫瘤組織高壓和血管高通透性的作用下由產(chǎn)生的部位快速穿過屏障進(jìn)入體液中，用于腫瘤檢測[1,5]。然而許多單一多肽或者蛋白質(zhì)標(biāo)志物用于疾病檢測的準(zhǔn)確度有限，尤其是面對(duì)分子機(jī)制復(fù)雜和異質(zhì)性極強(qiáng)的腫瘤時(shí)，其應(yīng)用受到限制。多肽組學(xué)是研究生物體內(nèi)多肽組成、結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科[1]。通過臨床大隊(duì)列的多肽組學(xué)研究可以篩選疾病相關(guān)差異多肽，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法整合多個(gè)疾病相關(guān)多肽或蛋白信息，形成蛋白/多肽指紋圖譜模型用于疾病的檢測和預(yù)測，可顯著提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和檢測人群的適用范圍[6-7]，因此可通過收集體液樣本進(jìn)行蛋白/多肽指紋圖譜檢測分析，用于腫瘤精準(zhǔn)檢測。相較于目前常見的其他液體活檢技術(shù)，如循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）、外泌體和微小RNA(microRNA,miRNA），蛋白/多肽指紋圖譜在敏感度、早期檢測準(zhǔn)確度和應(yīng)對(duì)腫瘤異質(zhì)性等方面具有一定優(yōu)勢（表1）。指導(dǎo)意見1：多肽包含豐富的疾病相關(guān)信息，可用于腫瘤檢測?；诙嚯慕M學(xué)數(shù)據(jù)篩選，整合多個(gè)腫瘤相關(guān)多肽的蛋白/多肽指紋圖譜較單一多肽，可為腫瘤檢測提供更精準(zhǔn)的結(jié)果。
2. 蛋白/多肽指紋圖譜檢測分析技術(shù)
2.1 臨床樣本的選擇通常用于蛋白/多肽指紋圖譜檢測的樣本包括體液、組織、原代細(xì)胞和培養(yǎng)液等，各種樣本均有優(yōu)勢和不足。體液樣本相對(duì)易獲取，利于連續(xù)取樣，同時(shí)一些體液樣本具有自我平衡屬性，檢測結(jié)果的重復(fù)性大幅提高。而組織和原代細(xì)胞樣本來源于特定組織區(qū)域，其蛋白/多肽指紋圖譜和組織本身關(guān)系更強(qiáng)。然而在腫瘤管理過程中，內(nèi)鏡學(xué)、影像學(xué)和組織病理學(xué)等臨床參考標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)在準(zhǔn)確度上具有明顯優(yōu)勢，對(duì)于發(fā)揮輔助角色的分子檢測技術(shù)，重點(diǎn)關(guān)注受檢者依從性和樣本易獲取性等。因此本專家共識(shí)重點(diǎn)闡述各體液樣本在蛋白/多肽指紋圖譜檢測分析中的特色。目前蛋白/多肽指紋圖譜檢測分析常用的體液包括血液、尿液、腦脊液和唾液等（表2)[8-15]。
血液樣本主要包括血漿和血清，兩者間多肽組存在差異[16]。嚴(yán)重溶血、嚴(yán)重脂血或嚴(yán)重黃疸樣本均建議重新采集。獲取血漿樣本的采血管中抗凝劑種類包括肝素、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid,EDTA）和檸檬酸鈉等，其中EDTA最常用，因?yàn)槠淇稍鰪?qiáng)多肽穩(wěn)定性[17]。采用真空血清采血管采集血液樣本后，至血清分離的時(shí)間間隔不宜>6 h。如果條件限制，需要延遲分離，則建議采樣后全血樣本2～8℃保存，12 h內(nèi)完成血清分離。血漿和血清轉(zhuǎn)移時(shí)應(yīng)盡可能避免吸入細(xì)胞或細(xì)胞碎片，分離前不可冷凍全血樣本，以免溶血。血漿或血清分離后應(yīng)在低溫下保存和轉(zhuǎn)運(yùn)，如果不能立即開展后續(xù)處理，可將樣本置于≤-70℃，期間避免反復(fù)凍融[18]，以免對(duì)多肽組檢測造成不利影響。采用血液樣本的優(yōu)勢在于采樣微創(chuàng)，各臨床機(jī)構(gòu)和健康管理中心經(jīng)驗(yàn)豐富，樣本可及性高。且血液樣本中蛋白/多肽豐度較高，達(dá)到60～80 mg/mL，其中包含很多來自疾病組織分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白/多肽，適用于多數(shù)疾病檢測，臨床轉(zhuǎn)化前景好[5]。然而血液樣本中蛋白/多肽濃度變化范圍較寬，>10個(gè)數(shù)量級(jí)[5]。這對(duì)多肽分離富集和檢測技術(shù)提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
表1 蛋白/多肽指紋圖譜和其他液體活檢技術(shù)用于腫瘤檢測的優(yōu)勢和不足
注ctDNA：循環(huán)腫瘤DNA；CTC：循環(huán)腫瘤細(xì)胞；miRNA：微小RNA(microRNA)
表2 蛋白/多肽指紋圖譜檢測常見體液樣本的特征分析
注NA：缺失值
尿液由腎臟生成，是經(jīng)輸尿管和膀胱排出的含有大量代謝終產(chǎn)物的液體。尿液中多肽約70%來自泌尿系統(tǒng)，尤其是腎和膀胱，因此可基于尿液蛋白/多肽指紋圖譜檢測泌尿系統(tǒng)疾病[19-20]。另外約30%的尿液多肽來自血液腎小球?yàn)V過，因此尿液蛋白/多肽指紋圖譜同樣可用于其他疾病的檢測[21-22]。通常尿液在排出前已在膀胱中儲(chǔ)存數(shù)小時(shí)，已完成內(nèi)源性多肽水解過程[23]，為了減少檢測結(jié)果的變異情況，建議采用晨尿的中段尿。尿液多肽在常溫下保存≤6 h時(shí)組成和濃度相對(duì)穩(wěn)定，≤-20℃可保存數(shù)年，期間避免反復(fù)凍融[24]。盡管飲食、鍛煉和飲水等可影響尿液多肽組，但相對(duì)而言，尿液是一種較為穩(wěn)定的樣本[5]。同時(shí)尿液采樣非侵入性，可重復(fù)采集，尿液中蛋白含量較低，且相對(duì)分子質(zhì)量<10 000的多肽高度富集[25]，這可能與小分子多肽更易通過腎小球?yàn)V過屏障有關(guān)[26]，這種特性降低了后續(xù)多肽分離富集和檢測的難度，也降低了高豐度蛋白對(duì)潛在蛋白/多肽指紋圖譜檢測信號(hào)的干擾程度[27]。因此尿液是多種疾病相關(guān)蛋白/多肽指紋圖譜檢測相對(duì)理想的樣本之一，尤其是泌尿系統(tǒng)腫瘤。
腦脊液是充滿在各腦室、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓中央管內(nèi)的無色透明液體，維持顱內(nèi)壓穩(wěn)定。腦脊液多肽主要來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌和血液中穿過血-腦脊液屏障的小分子[10-11]，被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病標(biāo)志物的重要來源。基于腦脊液蛋白/多肽指紋圖譜可用于神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、精神性疾病和腦腫瘤等的檢測[28-30]。然而腦脊液采樣存在侵入性，不易獲取，使得基于腦脊液蛋白/多肽指紋圖譜的檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用中受到一定限制。
唾液是由分布在口腔內(nèi)的主要唾液腺（腮腺、頜下腺和舌下腺）和其他腺體分泌的一種液體，采樣具有非侵入性的優(yōu)勢，基于唾液的蛋白/多肽指紋圖譜可進(jìn)行口腔疾病的檢測，如口腔癌[31]。然而由于蛋白進(jìn)入唾液中后即發(fā)生降解，且在唾液采集后降解過程依舊存在，使得唾液多肽組檢測結(jié)果的重復(fù)性大大降低。其他變量因素如年齡、性別和飲食等也會(huì)影響唾液多肽組[32]。這些因素加大了唾液蛋白/多肽指紋圖譜臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)。
其他體液樣本，包括淚液和漿膜腔積液等，也有關(guān)于蛋白/多肽指紋圖譜的研究報(bào)道。淚液樣本收集具有非侵襲性的優(yōu)勢，淚液多肽組在同一個(gè)體不同時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，然而個(gè)體間差異較大，增加了分析的復(fù)雜性[33]。重要的是淚液樣本目前主要評(píng)估眼部疾病，如干眼癥和瞼板腺功能障礙等，在腫瘤中的研究相對(duì)較少[34-35]。漿膜腔積液，包括胸腔積液和腹腔積液等，與靶組織較近，關(guān)系密切，其中含有腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境分泌的可溶性因子，通常與腫瘤晚期關(guān)系更加密切[36]。然而采樣具有侵入性，早期檢測的價(jià)值不足[37]，重要的是腫瘤中漿膜腔積液蛋白/多肽指紋圖譜研究相對(duì)較少，所報(bào)道的癌種較少，提供的證據(jù)和信息有限，因此仍需更多關(guān)于其蛋白/多肽指紋圖譜的研究以支持其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和臨床應(yīng)用。
指導(dǎo)意見2：樣本的選擇與檢測疾病類型和樣本可及性有關(guān)。血液和尿液臨床應(yīng)用前景相對(duì)較好。各類樣本采集后，應(yīng)盡快分離檢測組分，并低溫保存，避免反復(fù)凍融，以增加結(jié)果的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。
2.2 多肽的提取
檢測組分中多肽組檢測前，需對(duì)多肽進(jìn)行有效提取。而多肽易被蛋白酶/肽酶降解，導(dǎo)致蛋白/多肽指紋圖譜中疾病相關(guān)信息減弱甚至喪失，因此體外樣本預(yù)處理時(shí)間應(yīng)盡可能縮短[38]。在檢測組分保存前和多肽提取前，加入特異性和（或）廣譜性蛋白酶/肽酶抑制劑至樣本中，可抑制蛋白酶/肽酶活性，降低多肽水解程度[39]。然而有些蛋白酶/肽酶抑制劑就是多肽，或者是多肽類似物，加入后豐度相對(duì)較高，不僅增加了樣本中多肽的變異性，而且對(duì)內(nèi)源性多肽分析起到抑制作用[2]，因此需慎重考慮。除了加入蛋白酶/肽酶抑制劑外，收樣后快速冷凍是另一種方法，目的也是降低蛋白酶/肽酶對(duì)多肽的降解，同時(shí)減少凍融次數(shù)，并在冰上進(jìn)行多肽提取[18,31]。
另外生物樣本中多肽豐度相對(duì)較低，例如血清中小分子多肽占比<1%，其他22種大分子蛋白如清蛋白、α-1抗胰蛋白酶、α-2巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和γ-球蛋白等占比達(dá)99%以上[40]，在質(zhì)譜檢測過程中易覆蓋低豐度多肽信號(hào)。理想的多肽提取方法應(yīng)盡可能捕獲和富集更多多肽，尤其是疾病相關(guān)多肽，并去除高豐度干擾蛋白和其他小分子干擾物質(zhì)。
目前一些方法已用于去除高豐度干擾蛋白和其他小分子干擾物質(zhì)進(jìn)而富集多肽，如超濾離心、選擇性沉淀、固相萃取、磁珠法和免疫沉淀法等，對(duì)多肽的富集效率達(dá)到100～1000倍[41]。
超濾離心是最常用的多肽提取方法，運(yùn)用超濾膜分離低相對(duì)分子質(zhì)量多肽和高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白[42]。這種方法快速且易操作，然而可能導(dǎo)致直徑大于濾膜孔徑的多肽丟失，且難以去除直徑小于濾膜孔徑的其他小分子干擾物質(zhì)，比如代謝分子和脂質(zhì)，而這些小分子會(huì)降低質(zhì)譜檢測時(shí)多肽的電離效率，同時(shí)有些多肽易和濾膜結(jié)合，導(dǎo)致多肽的丟失[43]。
選擇性沉淀法運(yùn)用到多種樣本中的多肽提取，具有快速、高效、經(jīng)濟(jì)和重復(fù)性好的特點(diǎn)[44]。選擇性沉淀大分子高豐度蛋白，而低分子多肽和其他小分子干擾物質(zhì)保留在溶液中。常用沉淀試劑包括有機(jī)溶劑（乙腈、丙酮和甲醇）、酸（三氟乙酸）或硫酸銨等[41]，溶劑/酸和蛋白的作用很快，且能有效終止蛋白酶/肽酶活性。盡管沉淀法比較通用，但針對(duì)不同類型樣本需選擇合適的沉淀試劑，以提高多肽的提取效率[45]，同時(shí)操作需小心，盡可能減少大分子蛋白聚集時(shí)捕獲小分子多肽，導(dǎo)致檢測結(jié)果的一致性下降[46]。另外沉淀法雖然能高效去除高豐度蛋白，但脂質(zhì)和代謝分子仍在上清中存在，會(huì)干擾質(zhì)譜檢測時(shí)多肽的電離效率，有必要進(jìn)一步處理。采用水不相溶的有機(jī)溶劑乙酸乙酯或乙醚等可有效地回收生物樣本中多肽并去除其他小分子干擾物質(zhì)[43,47]，然而該方法重復(fù)性不足，目前只能作為實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手段。
固相萃取利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，可從復(fù)雜生物樣本中提取多肽，并去除大分子蛋白干擾，以及不需要的小分子干擾物質(zhì)和鹽等[48]，效果依賴于多肽和吸附劑的互作，也可用于沉淀法獲得的樣本中脂質(zhì)和疏水性小分子物質(zhì)的去除，提高多肽純度[49]。這種方法顯示出極佳的多肽提取效率和干擾物質(zhì)清除效率，然而有些相具有過度選擇性，不利于廣譜的多肽組學(xué)研究，且很多時(shí)候發(fā)現(xiàn)僅對(duì)某個(gè)亞類多肽具有很好的富集效果。
磁珠法可用于復(fù)雜生物樣本中的多肽富集和研究[50-51]，分離富集多肽的效果理想，包括弱陽離子交換磁珠（weak cation exchange magnetic beads,MB-WCX, 參考http://www.5000js.com/Product/1894201745.html）、金屬螯合磁珠（如銅離子螯合納米磁珠, 參考http://www.5000js.com/Product/8910524421.html）和疏水磁珠（如疏水C8磁珠，參考http://www.5000js.com/Product/0548721933.html）等，其中MB-WCX在平均出峰量、平均峰面積和平均峰強(qiáng)度等方面均占優(yōu)勢。然而磁珠法多肽富集試劑價(jià)格較高，且以科研型試劑為主，大規(guī)模的臨床應(yīng)用前景受限。
免疫沉淀法利用特異性抗體與多肽結(jié)合，特異性高，能有效檢測低豐度多肽[52-53]，目前臨床應(yīng)用已有>50年的歷史。該方法依賴于高特異性的抗體的開發(fā)，然而當(dāng)前合適的高特異性的抗體有限[54]，無法有效地對(duì)樣本中的多肽進(jìn)行全面分析。近年來，我國學(xué)者通過精確調(diào)控電化學(xué)蝕刻條件開發(fā)了具有納米級(jí)孔道的多孔硅顆粒材料，能有效捕獲富集小分子多肽而去除大分子高豐度蛋白，同時(shí)基于孔道排阻效應(yīng)抑制蛋白酶/肽酶和小分子多肽的酶解接觸，對(duì)多肽起到保護(hù)作用[55-56]。另外基于多肽不同的理化性質(zhì)，研究者通過對(duì)多孔硅顆粒材料進(jìn)行表面化學(xué)修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中低豐度多肽廣譜性和靶向性的捕獲富集[57-58]，且預(yù)處理步驟簡單，有效地降低多肽的損失和臨床應(yīng)用時(shí)間消耗。基于該技術(shù)，建立了產(chǎn)業(yè)化的多孔硅顆粒材料生產(chǎn)體系和質(zhì)量控制體系，開發(fā)了多款多肽提取試劑盒，并獲得了國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration,NMPA）備案證，解決了多肽組學(xué)檢測敏感度、穩(wěn)定性和重復(fù)性問題，為蛋白/多肽指紋圖譜相關(guān)檢測產(chǎn)品研發(fā)、轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
指導(dǎo)意見3：生物樣本中低豐度多肽高敏感度、高穩(wěn)定性和高重復(fù)性的捕獲富集是蛋白/多肽指紋圖譜相關(guān)檢測產(chǎn)品開發(fā)和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)?；诙嗫坠桀w粒材料開發(fā)的多肽提取方法和試劑盒極具臨床應(yīng)用前景。
2.3 蛋白/多肽指紋圖譜
檢測技術(shù)基于多肽組學(xué)數(shù)據(jù)分析和篩選疾病相關(guān)多肽，能為特定疾病的診斷、治療決策以及療效和預(yù)后評(píng)估提供理想的方法[5]。多肽組學(xué)的檢測常采用非靶向技術(shù)，以分析具有某特定疾病患者和不具有某特定疾病患者樣本中所有多肽的差異[4,59]。與靶向檢測技術(shù)比較，非靶向的多肽組學(xué)技術(shù)可同時(shí)分析眾多多肽特征峰水平。這對(duì)于揭示復(fù)雜且異質(zhì)性強(qiáng)的疾病極為關(guān)鍵?；诙鄠€(gè)多肽特征峰的蛋白/多肽指紋圖譜能顯著增加檢測的準(zhǔn)確度[6-7]。質(zhì)譜技術(shù)兼具高敏感度、高特異度和多指標(biāo)聯(lián)檢的優(yōu)勢，目前已廣泛用于多肽組學(xué)研究[60-61]，是分析和發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)多肽的主要工具。該技術(shù)可根據(jù)不同多肽分子的質(zhì)荷比（mass to charge ratio,m/z）微小差異高效檢測復(fù)雜樣本的蛋白/多肽指紋圖譜[62-65]。
目前用于多肽組檢測的質(zhì)譜技術(shù)有多種，主要包括液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（capillary electrophoresis mass spectrometry,CE-MS）、表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF MS）和基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）等[66]。
LC-MS/MS用于蛋白/多肽組檢測，敏感度和準(zhǔn)確度高，可檢測上千種多肽，提供大量生物學(xué)信息[67-68]，提升對(duì)復(fù)雜生物樣本的分析能力。然而LC-MS/MS對(duì)檢測組分前處理要求較高，有些脂質(zhì)和代謝物相對(duì)分子質(zhì)量和多肽類似，若沒有被有效去除，會(huì)干擾LC-MS/MS對(duì)蛋白/多肽組的檢測性能[48]。同時(shí)由于液相分離過程耗時(shí)長和通量低，臨床應(yīng)用時(shí)大批量樣本檢測受限。最關(guān)鍵的是LC-MS/MS自動(dòng)化難度較大，操作繁瑣，通常更適用于研發(fā)，無法將組學(xué)檢測直接用于臨床檢驗(yàn)。截至2024年6月30日共有53款LC-MS/MS獲得NMPA醫(yī)療器械注冊(cè)證，基于LC-MS/MS技術(shù)獲證的試劑盒也主要集中在維生素檢測、治療藥物監(jiān)測、激素類檢測、兒茶酚胺類檢測、膽汁酸檢測和新生兒篩查等方面，均是基于定量方式檢測單一或幾個(gè)小分子應(yīng)用于臨床。
CE-MS常用于尿液蛋白/多肽組檢測，可對(duì)低相對(duì)分子質(zhì)量的多肽進(jìn)行有效和高重復(fù)性的分析[69-70]。相對(duì)LC而言，CE的優(yōu)勢在于穩(wěn)健性、可重復(fù)性和對(duì)高pH環(huán)境的抗干擾能力較高，增加了結(jié)果的可比性[71-72]。另外整個(gè)分析過程中緩沖液組成保持不變，這為待分析物電離提供了一致的環(huán)境[73-74]。然而CE-MS相對(duì)耗時(shí)，不適合大樣本高通量檢測，臨床應(yīng)用前景受到一定限制。
SELDI-TOF MS用于蛋白/多肽組檢測已有許多報(bào)道，然而所使用的芯片有效表面積較小，對(duì)于小分子多肽富集不完全，不能完整地反映低豐度多肽所含有的生物學(xué)信息[75]。此外由于技術(shù)可重復(fù)性較差，易受多種因素影響，對(duì)于相同疾病的研究，不同實(shí)驗(yàn)室獲得的結(jié)果較難達(dá)到一致，限制其臨床應(yīng)用的價(jià)值[76]。
MALDI-TOF MS是目前國產(chǎn)替代最成熟的質(zhì)譜平臺(tái)，是極具臨床應(yīng)用前景的質(zhì)譜平臺(tái)。與其他檢測技術(shù)平臺(tái)比較，MALDI-TOF MS用于蛋白/多肽組檢測具有樣本前處理要求低、樣本量需求低、通量大、檢測效率高、抗干擾能力強(qiáng)、自動(dòng)化難度低和操作便捷等優(yōu)勢[77-79]。這使得MALDI-TOF MS可以全面識(shí)別生物樣本中的多肽組學(xué)信息以發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)多肽特征峰。在過去十余年，基于該技術(shù)平臺(tái)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤相關(guān)多肽[80-81]。MALDI-TOF MS成像可用于表征多肽組成以提供分子空間分布分析。該分析可與常規(guī)組織學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合，分析感興趣的組織學(xué)區(qū)域中數(shù)百個(gè)靶點(diǎn)的分布[82-83]。這為探索惡性疾病相關(guān)分子的空間分布異質(zhì)性提供了最佳手段，比如多種腫瘤[84-85]，可以區(qū)分不同亞型和不同級(jí)別腫瘤，從而為治療決策提供信息。截至2024年6月30日共有44款MALDI-TOF MS獲得NMPA注冊(cè)證?；贛ALDI-TOF MS技術(shù)獲證的試劑盒應(yīng)用領(lǐng)域包括微生物檢測和基因檢測等，其中微生物檢測是基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定獲得結(jié)果，這與基于蛋白/多肽指紋圖譜的人工智能模型預(yù)測或者數(shù)據(jù)庫比對(duì)來檢測疾病的邏輯一致。在液體活檢領(lǐng)域目前已有用于人體血清樣本中蛋白/多肽指紋圖譜采集的MALDI-TOF MS獲得了NMPA注冊(cè)證，可進(jìn)行人體血清蛋白/多肽指紋圖譜的檢測。
指導(dǎo)意見4：質(zhì)譜技術(shù)是蛋白/多肽指紋圖譜檢測的重要平臺(tái)，其臨床應(yīng)用需重點(diǎn)考慮樣本前處理要求、檢測成本、檢測效率、結(jié)果可重復(fù)性和操作便捷性等因素，其中MALDI-TOF MS在蛋白/多肽指紋圖譜檢測技術(shù)的轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用上具有一定的優(yōu)勢。
2.4 蛋白/多肽指紋圖譜的檢測數(shù)據(jù)分析
通常蛋白質(zhì)組學(xué)中，質(zhì)譜檢測的MS/MS光譜采用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析，包括PEAKS、ProteinPilot或MaxQuant等。這些軟件利用不同的算法識(shí)別蛋白片段，然后在數(shù)據(jù)庫中檢索，識(shí)別所屬的蛋白和鑒定序列。然而常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)研究通常采用特定的蛋白酶消化后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，比如采用胰蛋白酶，其N端或C端氨基酸位點(diǎn)比較一致。而多肽的N端和C端氨基酸序列受多種蛋白酶/肽酶消化的影響，比較復(fù)雜，基于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫分析難以獲得高準(zhǔn)確度的結(jié)果。這對(duì)蛋白/多肽指紋圖譜的檢測數(shù)據(jù)分析帶來了極大挑戰(zhàn)。一種方法是檢索SATPdb和SwePep等多肽組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。這些數(shù)據(jù)庫包含了最新研究發(fā)現(xiàn)的治療性或內(nèi)源性多肽[86-87]。另外多肽的翻譯后修飾（post-translational modifications,PTMs）對(duì)于多肽和受體的互作和拮抗蛋白酶/肽酶的消化至關(guān)重要，常見的PTMs包括C端的酰胺化和N端的乙?；?，另外還有甲硫氨酸氧化以及精氨酸和谷氨酰胺脫酰胺。這些修飾給蛋白/多肽指紋圖譜的檢測數(shù)據(jù)分析帶來了新的挑戰(zhàn)。PERKS軟件可對(duì)多肽及其PTMs進(jìn)行有效分析[49]。在蛋白/多肽指紋圖譜的檢測數(shù)據(jù)分析過程中，需要重要考慮的一個(gè)因素是過濾搜索結(jié)果，此時(shí)應(yīng)用到錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率閾值，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的和理論光譜數(shù)都達(dá)到數(shù)千個(gè)，考慮到各種切割模式和PTMs修飾，錯(cuò)誤匹配的可能性較大。為了降低這種可能性，通常采用和多肽氨基酸組成一致但序列翻轉(zhuǎn)或打亂的誘餌進(jìn)行檢索，評(píng)估在數(shù)據(jù)庫中檢索時(shí)假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能分值[88]。
生物體內(nèi)部分多肽具有生物活性，如細(xì)胞因子、生長因子和激素等。PeptideRanker和PeptideLocator可用于分析多肽序列是否具有生物活性[89-90]。比如PeptideRanker分值>0.5提示具有潛在生物活性。一些常見的多肽激素類物質(zhì)在此軟件中預(yù)測分值較高，然而仍有部分假陰性和假陽性結(jié)果，需慎重對(duì)待。
多肽組學(xué)檢測為疾病相關(guān)蛋白/多肽指紋圖譜的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。許多單一多肽用于疾病檢測的準(zhǔn)確度有限，尤其是面對(duì)分子機(jī)制和特征復(fù)雜、異質(zhì)性極強(qiáng)的疾病時(shí)，限制了其應(yīng)用。通過人工智能整合多個(gè)多肽特征峰的蛋白/多肽指紋圖譜可增加結(jié)果的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和降低變異系數(shù)[91-93]，同時(shí)特異度也顯著提高[92]。蛋白/多肽指紋圖譜模型需依據(jù)《人工智能醫(yī)療器械注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》構(gòu)建[94]。
首先應(yīng)建立明確的訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和測試集隊(duì)列，每個(gè)隊(duì)列中總樣本量和各分組樣本量的計(jì)算可參考原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)原則》給出的方法進(jìn)行計(jì)算[95]，從而滿足抽樣誤差的要求，在條件允許的情況下盡量提高樣本量。隊(duì)列內(nèi)分組比例可參考全國流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，對(duì)于各分組比例未獲得全國流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的疾病，隊(duì)列設(shè)計(jì)可依據(jù)各機(jī)構(gòu)掌握的先驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)分組的比例，隊(duì)列內(nèi)和隊(duì)列間無樣本重復(fù)；
其次由于不同地區(qū)和不同臨床機(jī)構(gòu)在人群組成、流行病學(xué)特征和樣本采集操作等方面可能存在差異，為保證隊(duì)列樣本的代表性，各隊(duì)列樣本應(yīng)來源不同省市有代表性的臨床中心，以提高算法模型的泛化能力，降低偏倚；
再者，建議對(duì)各隊(duì)列中各樣本采集、預(yù)處理、標(biāo)注和存儲(chǔ)等環(huán)節(jié)建立規(guī)范流程和詳細(xì)記錄，形成體系化管理，保障樣本的穩(wěn)定性。對(duì)于體外診斷產(chǎn)品的開發(fā)，需根據(jù)臨床信息，如病理結(jié)果、鏡檢結(jié)果、影像結(jié)果和其他標(biāo)志物結(jié)果等，來標(biāo)注陰陽性分類和亞型分類等。同時(shí)，可根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期使用人群、地區(qū)和流行病學(xué)特征，對(duì)其他生理異?；虿∽冞M(jìn)行標(biāo)注，作為算法訓(xùn)練的標(biāo)簽。樣本收集和臨床信息獲取應(yīng)獲得倫理批準(zhǔn)或者豁免。樣本的采集和保存，以及信息的傳輸和使用應(yīng)符合《中華人民共和國網(wǎng)絡(luò)安全法》、《科技部人類遺傳資源管理辦法》和原國家食品藥品監(jiān)督管理總局《醫(yī)療器械網(wǎng)絡(luò)安全注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》等法律法規(guī)的要求[96-98]；
隨后，收到的樣本應(yīng)建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，剔除不合格樣本。多肽組的檢測需制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standard operating procedure,SOP），按照SOP獲取各樣本多肽組學(xué)數(shù)據(jù)，并針對(duì)多肽組學(xué)數(shù)據(jù)建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，剔除不合格數(shù)據(jù)，篩選滿足質(zhì)量要求的數(shù)據(jù)，特別是對(duì)于質(zhì)控樣本的多肽檢測信號(hào)的變異控制，建議批間變異系數(shù)≤15%；
最后由于多肽和疾病的關(guān)系復(fù)雜，疾病精準(zhǔn)檢測的蛋白/多肽指紋圖譜構(gòu)建離不開數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理和人工智能技術(shù)的應(yīng)用[99-100]。多肽組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理及歸一化后，采用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法建立包含多個(gè)多肽特征峰的集成模型。機(jī)器學(xué)習(xí)算法包括邏輯回歸、隨機(jī)森林（random forest,RF）和支持向量機(jī)（support vector machine,SVM）等[101-103]?；跇?biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理和機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立的模型，需通過測試集驗(yàn)證后完成模型定型，并建立判別診斷軟件。包含定型模型的診斷軟件需進(jìn)一步通過建模后新采集的外部獨(dú)立測試隊(duì)列數(shù)據(jù)進(jìn)行模型性能測試，并獲取模型性能評(píng)估結(jié)果。診斷軟件應(yīng)用前需進(jìn)一步在與預(yù)期臨床應(yīng)用場景相吻合的人群隊(duì)列中開展前瞻性臨床研究（圖1）。
指導(dǎo)意見5：疾病相關(guān)蛋白/多肽指紋圖譜模型構(gòu)建需依據(jù)《人工智能醫(yī)療器械注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》[94]，基于多家代表性臨床中心大樣本建立符合統(tǒng)計(jì)學(xué)和流行病學(xué)的訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和測試集。樣本采集和信息收集應(yīng)在符合法律法規(guī)的基礎(chǔ)上建立體系化管理體系。樣本和多肽組學(xué)數(shù)據(jù)需建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)明確是否符合要求。多肽組的檢測應(yīng)采用統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，對(duì)多肽組學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并結(jié)合人工智能算法進(jìn)行疾病相關(guān)多肽篩選和精準(zhǔn)檢測模型構(gòu)建。模型性能需通過獨(dú)立測試隊(duì)列和前瞻性隊(duì)列進(jìn)行評(píng)估。
3. 蛋白/多肽指紋圖譜檢測的腫瘤臨床應(yīng)用
3.1 蛋白/多肽指紋圖譜檢測用于腫瘤診斷
腫瘤診斷包括早篩和輔助診斷。目前已有基于多肽的產(chǎn)品在腫瘤診斷中的應(yīng)用，如用于小細(xì)胞肺癌檢測的胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin releasing peptide,Pro-GRP)[104]和用于甲狀腺髓樣癌檢測的降鈣素等[105]。2009年獲得美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準(zhǔn)用于評(píng)估有盆腔包塊的患者罹患卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)的OVA1TM測試，包括糖類抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125）、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、載脂蛋白A1、β2-微球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，其中甲狀腺素運(yùn)載蛋白和載脂蛋白A1是多肽分子，特異性高，是主要定性標(biāo)志物[106-108]。這些應(yīng)用初步顯示了多肽在臨床腫瘤診斷中的價(jià)值[109]。目前在多種腫瘤中，研究者廣泛開展了蛋白/多肽指紋圖譜檢測產(chǎn)品的研發(fā)和驗(yàn)證工作（表3)[56,110-114]。
肺癌是我國發(fā)病率和死亡率均位居第1位的惡性腫瘤[115]。早期篩查和精準(zhǔn)檢測有助于降低肺癌發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[116-117]。通過MALDI-TOF MS檢測非小細(xì)胞肺癌血清多肽組，發(fā)現(xiàn)11個(gè)差異多肽，基于遺傳算法（genetic algorithm,GA）建立的模型包含2個(gè)多肽特征峰，敏感度和特異度分別高達(dá)92.9%和91.7%[118]。另外也有學(xué)者通過MALDI-TOF MS檢測血清多肽組，基于K-近鄰算法（K-nearest neighbor,KNN）建立包含5個(gè)差異性多肽的非小細(xì)胞肺癌診斷模型，測試集敏感度和特異度分別高達(dá)80.7%和91.2%[119]。近期，研究者基于ClinMS-PlatⅠ血清多肽指紋圖譜檢測技術(shù)，納入了12家大型臨床中心的11 345例肺癌隊(duì)列樣本進(jìn)行肺癌的血清蛋白/多肽指紋圖譜檢測，對(duì)于肺部結(jié)節(jié)患者同時(shí)結(jié)合CT影像特征數(shù)據(jù)，進(jìn)行人工智能分析，建立模型。模型經(jīng)測試集評(píng)估敏感度和特異度分別高達(dá)90.4%和97.6%，其中原位癌檢出率85.7%，Ⅰ期肺癌檢出率高達(dá)90.8%，針對(duì)臨床難判結(jié)節(jié)相對(duì)集中的5～15 mm肺結(jié)節(jié)的檢測準(zhǔn)確度高達(dá)93.2%，展現(xiàn)出優(yōu)異的性能[56]。目前該項(xiàng)研究成果已實(shí)現(xiàn)定型和產(chǎn)品化，可以優(yōu)化肺癌的低劑量螺旋CT檢測中的假陽性和漏檢問題[120]，為肺癌和肺結(jié)節(jié)的臨床檢測提供診療參考。
圖1 蛋白/多肽指紋圖譜檢測技術(shù)建立流程圖
表3 蛋自/多肽指紋圖譜在腫瘤診斷中的主要研究及其階段
注MALDI-TOF MS：基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜；LDT：實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目；CE-MS：毛細(xì)管電泳質(zhì)譜；NA：缺失值（not available)
消化系統(tǒng)腫瘤在我國發(fā)病率較高，其中結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、食管癌和胰腺癌五大癌種均位居前十，且是除肺癌外死亡率最高的五大癌種[115]，早篩早診對(duì)于消化系統(tǒng)五癌防控意義重大[121-125]。目前指南和專家共識(shí)推薦的消化系統(tǒng)五癌篩查和早診技術(shù)以內(nèi)鏡學(xué)和影像學(xué)為主[122-124,126-127]，存在侵入性或輻射危害，依從性低，資源有限，臨床急需新的液體活檢技術(shù)對(duì)消化系統(tǒng)五癌高危人群進(jìn)行富集，減少不必要的內(nèi)鏡學(xué)或影像學(xué)檢查，提高高危人群依從性，降低醫(yī)療負(fù)擔(dān)。有學(xué)者基于多肽組學(xué)數(shù)據(jù)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network,ANN）構(gòu)建了包含4個(gè)多肽特征峰的結(jié)直腸癌檢測模型，敏感度和特異度分別高達(dá)91%和93%[128]。另一個(gè)基于5個(gè)多肽特征峰建立的模型診斷結(jié)直腸癌的敏感度和特異度分別高達(dá)82%和93%[129]。基于MALDI-TOF MS平臺(tái)檢測多肽組，采用邏輯回歸建立的包含5個(gè)多肽的診斷模型診斷結(jié)直腸癌敏感度和特異度分別高達(dá)95.6%和87.9%[130]?；谀蛞憾嚯慕M學(xué)數(shù)據(jù)建立的包含31個(gè)多肽特征峰的模型對(duì)肝細(xì)胞癌和非肝細(xì)胞癌人群（包括肝硬化、非肝硬化肝疾病和健康人群）判別的敏感度和特異度分別為79.5%和85.1%[110]?；诙嚯慕M學(xué)數(shù)據(jù)和徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（radial basis function neural network,RBFNN）建立的包含6個(gè)多肽特征峰的模型用于識(shí)別肝細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移患者的敏感度和特異度分別為85.3%和85.7%，受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic,ROC）曲線下面積為0.911[81]。基于多肽組學(xué)數(shù)據(jù)，通過GA、有監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（supervised neural network,SNN）和快速分類（quick classifier,QC）算法構(gòu)建的蛋白/多肽指紋圖譜診斷模型，診斷胃癌的平均敏感度和特異度分別為79.3%和86.5%[111]。采用QC算法構(gòu)建的包含5個(gè)多肽特征峰的食管鱗狀細(xì)胞癌診斷模型的敏感度和特異度分別高達(dá)98.5%和97.2%[112]。采用經(jīng)多肽組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)的m/z為3 884和5 959的2個(gè)多肽建立的模型用于識(shí)別胰腺癌，敏感度和特異度分別高達(dá)86.3%和97.6%。在常規(guī)腫瘤標(biāo)志物CA19-9和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）檢測過程中，加入m/z為3 884的多肽，可有效提升結(jié)果的準(zhǔn)確度[131]。這些研究表明，蛋白/多肽指紋圖譜在消化系統(tǒng)五癌篩查和輔助診斷中的巨大潛力，然而尚需開展多中心大樣本的研究驗(yàn)證其性能。
近期，研究者基于ClinMS-PlatⅠ血清多肽指紋圖譜檢測技術(shù)，納入12家不同中心的11 097例結(jié)直腸癌隊(duì)列臨床樣本進(jìn)行結(jié)直腸癌的血清蛋白/多肽指紋圖譜的建模、測試和驗(yàn)證。經(jīng)驗(yàn)證，結(jié)直腸癌血清多肽指紋圖譜模型的敏感度和特異度分別高達(dá)85.8%和89.6%，其中早期結(jié)直腸癌檢出率高達(dá)85.6%，顯示早診的特性，有助于降低結(jié)直腸癌發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[56]。目前該項(xiàng)研究成果已實(shí)現(xiàn)定型和產(chǎn)品化。另外在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，基于尿液多肽組學(xué)數(shù)據(jù)和KNN算法篩選的5個(gè)多肽特征峰建立的模型對(duì)膀胱癌診斷的敏感度高達(dá)93.4%，其中早期檢出率90.0%，在健康人群和血尿癥患者中的特異度分別為97.8%和73.3%[132]。有研究分析721例膀胱癌患者尿液多肽組，基于SVM建立了包含116個(gè)多肽的蛋白/多肽指紋圖譜模型，用于膀胱癌檢測，經(jīng)大樣本驗(yàn)證后顯示，對(duì)于膀胱癌的敏感度和特異度分別為91.1%和67.6%[113]。在生殖系統(tǒng)腫瘤中，基于多肽組學(xué)數(shù)據(jù)來源的蛋白/多肽指紋圖譜可有效區(qū)分Ⅰ期卵巢癌患者和非卵巢癌人群[133]。序列為VSFELFADK和FEDENFILK的2個(gè)多肽在卵巢癌患者血漿中水平增加，檢測卵巢癌的特異度均為100%，敏感度分別為75%和78.6%[134]?；谘逯?個(gè)差異多肽[谷氨酸-酪氨酸（Glu-Trp）、羥脯氨酸-亮氨酸（Hyp-Leu）和苯丙氨酸-苯丙氨酸（Phe-Phe）]檢測早期上皮性卵巢癌的敏感度和特異度分別為63.6%和84.5%，雖然與腫瘤標(biāo)志物CA125（敏感度81.8%，特異度63.8%）性能相似，但與CA125聯(lián)合后敏感度和特異度分別高達(dá)80.4%和94.4%[135]。在前列腺癌中，分析823例前列腺特異性抗原（prostate specific antigen,PSA)<15 ng/mL患者的尿液多肽組，基于SVM建立了包含19個(gè)差異多肽的蛋白/多肽指紋圖譜模型。在280例前列腺癌外部驗(yàn)證隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)，該模型對(duì)高級(jí)別前列腺癌以及低級(jí)別前列腺癌和（或）非泌尿系統(tǒng)疾病的敏感度和特異度分別為89.6%和59.1%[114]。在乳腺癌中，基于SVM篩選的3個(gè)差異性多肽特征峰建立的診斷模型的敏感度和特異度分別高達(dá)91.9%和91.7%，而傳統(tǒng)乳腺癌標(biāo)志物CA15-3對(duì)同一人群的敏感度和特異度僅為41.7%和43.2%[136]。
除了在單癌種篩查和輔助診斷中的研究外，在多癌種檢測中，蛋白/多肽指紋圖譜檢測也顯示出優(yōu)異性能?；贛ALDI-TOF MS檢測和無監(jiān)督聚類分析的研究發(fā)現(xiàn)，血清中651個(gè)多肽可有效區(qū)分前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌和對(duì)照人群，并且在3種腫瘤中血清蛋白/多肽指紋圖譜特征不同[137]。近期，研究者基于ClinMS-PlatⅠ血清多肽指紋圖譜檢測技術(shù)，納入14家臨床中心11 921例樣本，建立了包括結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、食管癌和胰腺癌消化系統(tǒng)五大癌種的檢測模型，模型的敏感度和特異度分別高達(dá)82.3%和89.7%，早期檢出率也高達(dá)81.3%，同時(shí)癌種溯源綜合準(zhǔn)確度達(dá)到83.1%[56]。
指導(dǎo)意見6：蛋白/多肽指紋圖譜檢測為腫瘤檢測提供了一種高效、便捷、精準(zhǔn)且具有廣泛應(yīng)用潛力的方法。初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺部腫瘤和結(jié)直腸腫瘤的早期檢測、肺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別和消化系統(tǒng)五大癌種（結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、食管癌和胰腺癌）的聯(lián)合檢測。其他基于蛋白/多肽指紋圖譜檢測的產(chǎn)品處于基礎(chǔ)研究層面，尚未成熟。
3.2 蛋白/多肽指紋圖譜檢測用于腫瘤精準(zhǔn)治療決策
指導(dǎo)蛋白/多肽指紋圖譜檢測同樣可用于腫瘤精準(zhǔn)治療決策指導(dǎo)（表4)[138-146]。2007年，Taguchi等[138]使用MALDI-TOF MS檢測非小細(xì)胞肺癌患者的血清樣本獲得多肽組學(xué)數(shù)據(jù)，基于其中8個(gè)差異多肽建立模型，可有效預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者使用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epithelial growth factor receptor tyrosine-kinase inhibitors,EGFR-TKIs）后的臨床預(yù)后情況。隨后這個(gè)模型被應(yīng)用于商品化檢測項(xiàng)目VeriStrat。該項(xiàng)目的效果已在非小細(xì)胞肺癌的多項(xiàng)個(gè)體化治療研究中得到驗(yàn)證[139-140]，并通過FDA審核，被納入2016年的美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南建議[141-143]。一個(gè)基于血漿多肽組學(xué)數(shù)據(jù)和RF算法建立的包含3個(gè)多肽的模型有效區(qū)分局部進(jìn)展期直腸癌患者術(shù)前新輔助放化療的敏感性，敏感度達(dá)到77.8%，特異度為91.7%，總體準(zhǔn)確度為85.7%[144]。我國研究者通過分析晚期肺鱗癌患者接受紫杉醇聯(lián)合鉑類化療前血液樣本多肽組，基于5個(gè)差異多肽特征峰建立了晚期肺鱗癌患者接受紫杉醇聯(lián)合鉑類化療方案的敏感性預(yù)測模型，敏感度為90.0%，特異度為80.0%[145]。轉(zhuǎn)移性黑色素瘤預(yù)后較差，免疫治療作為一線或二線可選的治療方案能有效改善患者無進(jìn)展生存期和總生存期，然而僅30%的患者對(duì)免疫治療有反應(yīng)，傳統(tǒng)采用免疫組織化學(xué)檢測程序性死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1）難以有效篩選出對(duì)免疫治療響應(yīng)人群。有研究采用MALDI-TOF MS分析免疫治療前轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者血清樣本多肽組發(fā)現(xiàn)，基于其中209個(gè)多肽特征峰的蛋白/多肽指紋圖譜能有效預(yù)測患者對(duì)免疫治療的敏感性，并經(jīng)過5組共170例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者驗(yàn)證，HR=0.15(95%CI:0.06～0.40)[146]。
表4 蛋白/多肽指紋圖譜在腫瘤精準(zhǔn)治療決策指導(dǎo)中的主要研究及其階段
注EGFR-TKIs：表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑；MALDI-TOF MS：基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜；NCCN：美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)；
指導(dǎo)意見7：蛋白/多肽指紋圖譜檢測已成功應(yīng)用于評(píng)估EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌患者使用EGFR-TKIs的預(yù)后情況，輔助臨床做出治療決策。一些蛋白/多肽指紋圖譜檢測與直腸癌和黑色素瘤等的治療敏感性有關(guān)，但仍需更多臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
3.3 蛋白/多肽指紋圖譜檢測用于腫瘤患者療效和預(yù)后評(píng)估
腫瘤治療后，需對(duì)其療效和預(yù)后進(jìn)行監(jiān)測，評(píng)估治療效果和及時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)情況。有研究通過硅納米材料試劑盒捕獲多肽結(jié)合MALDI-TOF MS建立模型檢測蛋白/多肽指紋圖譜可以預(yù)測轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案的治療反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)間-alpha-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(interalpha-trypsin inhibitor heavy chain 4,ITIH4）及其肽段與結(jié)直腸癌對(duì)5-FU的耐藥性相關(guān)[147]。另有研究發(fā)現(xiàn)，多肽Pro-GRP不僅可用于小細(xì)胞肺癌的診斷，同樣可在其復(fù)發(fā)監(jiān)測中發(fā)揮作用，敏感度和特異度分別為70%和91%[148]。有學(xué)者分析636例膀胱癌患者尿液多肽組，基于SVM建立了包含106個(gè)多肽的蛋白/多肽指紋圖譜模型。該模型對(duì)膀胱癌復(fù)發(fā)預(yù)測的敏感度和特異度分別高達(dá)87%和57%[113]；隨后經(jīng)有隨訪結(jié)果的331例患者驗(yàn)證，顯示出良好的預(yù)后評(píng)估價(jià)值（HR=3.15,95%CI:1.73～5.70)[149]。采用MALDI-TOF MS檢測揭示乳腺癌血清多肽組的研究發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原α鏈（fibrinogen alpha chain,FGA) 605-629、ITIH 347-356和載脂蛋白A2(apolipoprotein A2,APOA2) 43-52共3個(gè)多肽組合模型可用于乳腺癌的診斷和評(píng)估預(yù)后情況[150]。
指導(dǎo)意見8：蛋白/多肽指紋圖譜檢測在腫瘤患者療效和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用潛力有待挖掘，目前處于基礎(chǔ)研究階段，仍需大量的臨床數(shù)據(jù)支持，以擴(kuò)展至更多癌種。
4. 小結(jié)與展望
腫瘤是全球人類死亡的主要原因之一，對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)檢測是提高療效和降低發(fā)病率、死亡率與醫(yī)療負(fù)擔(dān)的有效方式。目前，蛋白/多肽指紋圖譜研究正處于蓬勃發(fā)展階段，蛋白/多肽指紋圖譜的檢測分析方法和臨床應(yīng)用正日益受到重視，并在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力，多款多肽檢測產(chǎn)品的臨床應(yīng)用顯示了良好的價(jià)值。我國研究者近年來也基于蛋白/多肽指紋圖譜推出了多款腫瘤檢測產(chǎn)品，包括單癌種和多癌種。
未來期望更多的研究關(guān)注以下方面以拓展蛋白/多肽指紋圖譜在臨床腫瘤防控中的應(yīng)用：
（1）深入揭示腫瘤中多肽的表達(dá)機(jī)制，研究不同多肽在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)治療的敏感性與耐藥性的影響和機(jī)制，為后續(xù)蛋白/多肽指紋圖譜檢測產(chǎn)品的開發(fā)提供更加扎實(shí)的理論依據(jù)；
（2）技術(shù)層面，開發(fā)新型多肽捕獲富集和保護(hù)技術(shù)和檢測技術(shù)，提升檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和準(zhǔn)確度，建立符合臨床要求的檢測流程，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；
（3）利用機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)算法對(duì)多肽組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從海量的多肽組學(xué)數(shù)據(jù)中識(shí)別出具有診斷或預(yù)后意義的多肽特征峰，將多種多肽特征峰組合建立蛋白/多肽指紋圖譜模型，以及與其他生物標(biāo)志物結(jié)合，或組學(xué)數(shù)據(jù)整合，構(gòu)建更可靠的模型；
（4）開展多中心大樣本的臨床研究，綜合評(píng)估模型性能，并在預(yù)期應(yīng)用場景中開展前瞻性研究，以及真實(shí)世界評(píng)估對(duì)人群腫瘤發(fā)病率與死亡率的影響和經(jīng)濟(jì)效益情況。本專家共識(shí)全面梳理了蛋白/多肽指紋圖譜的檢測分析技術(shù)、臨床應(yīng)用及其在腫瘤管理中的潛力，提出了一系列具有前瞻性和實(shí)踐指導(dǎo)意義的共識(shí)推薦。未來，期待本專家共識(shí)進(jìn)一步落地和實(shí)踐，助力蛋白/多肽指紋圖譜檢測產(chǎn)品的研發(fā)、轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用，為居民的健康保駕護(hù)航。
專家組成員（按姓名漢語拼音字母排序）：陳湖光（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院）、陳益定（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院）、丁小文（浙江省腫瘤醫(yī)院）、范鈺（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院）、高越（杭州市第一人民醫(yī)院）、韓明勇（深圳大學(xué)附屬華南醫(yī)院）、何正富（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院）、胡集祎（上海市質(zhì)子重離子醫(yī)院）、黃凌（廣東省人民醫(yī)院）、姜武（中山大學(xué)腫瘤防治中心）、梁文華（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院）、梁霄（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院）、劉建（浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院）、沈虹（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院）、宋章法（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院）、談潔（湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院）、唐勇（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院）、王彩琴（湖南省腫瘤醫(yī)院）、鄔建敏（浙江大學(xué)化學(xué)系）、熊斌（武漢大學(xué)中南醫(yī)院）、余捷凱（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院）、袁瑛（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院）、翟曉慧（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院）、張大（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院）、張燕（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院）
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