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Ali Akbar Ashkarran, Decentralized nanoparticle protein corona analysis may misconduct biomarker discovery, Nano Today, Volume 62, 2025, 102745,
ISSN 1748-0132, https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102745.

摘要

蛋白質/生物分子蛋白冠 （PC） 是納米顆粒 （NP） 暴露于血液或血清等生物體液后在納米顆粒 （NP） 表面形成和進化的生物層。PC 的組成反映了生物環(huán)境，并受生物體疾病狀態(tài)的影響。因此，PC 可以用作生物標志物庫，其中疾病特異性蛋白質或蛋白質吸附模式的改變表明存在癌癥、心血管疾病或感染等疾病。研究人員越來越多地利用 NPs-蛋白質相互作用來發(fā)現疾病的生物標志物，希望將 PC 用作病理狀態(tài)的分子指紋，與傳統(tǒng)方法相比具有獨特的優(yōu)勢。NP 為蛋白質結合提供高表面積，充當通常難以檢測的低豐度蛋白質的富集工具。此外，特定蛋白質與 NPs 表面之間的相互作用可以反映蛋白質構象或功能的改變，為疾病病理生理學提供進一步的見解。

圖 1.體外和體內暴露于生物體液中 PC 形成的示意圖以及使用 LC-MS/MS 分析 PC 成分。

迄今為止，液相色譜-質譜聯用 （LC-MS/MS） 仍然是表征 PC 和鑒定具有潛在診斷價值的此類蛋白質的主要方法。然而，質譜法在多大程度上促進了評估 PC 組成的技術變化，以及這些蛋白質組學結果如何影響納米生物界面的解釋，在很大程度上仍未得到探索。為了解決這一問題并強調我們工作的新穎性，我們在引言中添加了詳細的討論，強調了分散式蛋白質蛋白冠 （PC） 分析的獨特方面，這在以前的文獻中沒有得到充分探討。具體來說，我們的研究側重于跨多個平臺的分散工作流程帶來的方法挑戰(zhàn)，強調需要協(xié)調的協(xié)議來確保生物標志物發(fā)現的可重復性和可靠性。

據報道，從生物液體的處理和儲存，到 NPs 制備，方法學上的不一致會引入顯著的可變性，從而影響蛋白質組學結果的準確性。這些不一致會導致誤解，最終阻礙納米醫(yī)學應用的臨床轉化。此外，物理化學性質（例如，大小、電荷、表面化學等）的表征不足嚴重影響了納米生物界面數據的解釋。在這里，我們討論了這種可變性在分散的環(huán)境中進一步加劇，其中樣品制備、儀器、數據收集和分析在多個實驗室中進行，每個實驗室都采用不同的協(xié)議。在影響納米生物界面數據的各種參數中，這項工作專門為 PC 成分的分散分析如何影響生物標志物的發(fā)現提供了一個新的視角，并通過標準化方法提出了可行的解決方案。

隨著 PC 分析的分散方法變得越來越普遍，這一研究領域面臨著重大挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)可能導致在納米醫(yī)學領域（如生物標志物發(fā)現）得出誤導性結論甚至不當行為。分散式 NP 的 PC 分析，即跨多個核心設施或平臺進行分析和數據收集，存在數據多樣性等缺點。事實上，這些平臺在方法、樣品制備和數據解釋方面的不一致威脅著生物標志物鑒定工作的可重復性和有效性。在這種觀點中，我們認為分散式 NP 的 PC 分析可能會引入可變性和偏差，導致不正確的生物標志物發(fā)現，從而可能損害基于納米粒子的診斷技術的未來。

質譜分析是生物標志物發(fā)現的關鍵要素

MS 在生物標志物發(fā)現中起著至關重要的作用，因為它能夠以高靈敏度和特異性識別、定量和表征各種生物分子，特別是檢測低豐度蛋白質或肽。這在生物標志物發(fā)現中特別有用，因為生物體液中可能以非常少量的方式存在潛在的疾病標志物。此外，MS 可以與其他組學技術（例如基因組學、代謝組學）集成，以創(chuàng)建多組學數據集，通過將遺傳變異與蛋白質表達和代謝途徑聯系起來來增強生物標志物的發(fā)現。MS 是生物標志物發(fā)現不可或缺的一些關鍵要素，包括但不限于蛋白質組范圍的鑒定、蛋白質豐度的定量、翻譯后修飾 （PTM）、生物標志物驗證和多重檢測能力。這對于生物標志物發(fā)現至關重要，用于檢測可能以低濃度存在的疾病相關蛋白質，從而提供健康狀態(tài)與患病狀態(tài)下蛋白質表達的整體視圖。此外，LC-MS/MS 可以對蛋白質豐度進行定量分析，從而深入了解蛋白質水平如何隨特定疾病、治療或環(huán)境因素而變化。此外，無標記定量或同量異位標記（例如，串聯質量標簽 （TMT） 或用于相對和絕對定量的同量異位標簽 （iTRAQ）方法使研究人員能夠比較多種條件下的蛋白質水平，這是識別用于診斷或預后應用的潛在生物標志物的關鍵。此外，LC-MS/MS 可以檢測磷酸化、糖基化和泛素化等 PTM，這些通常在疾病過程中起著至關重要的作用。

最近的進展證明了 PC 分析在生物標志物發(fā)現和癌癥診斷方面的變革潛力。Wang 等人開發(fā)了蛋白質釣魚方法，將 NPs 的 PC 形成與機器學習相結合，以富集低豐度蛋白質并耗盡高豐度蛋白質，對早期非小細胞肺癌的診斷準確率達到 91.38%。同樣，Xie 等人引入了一種血清蛋白變性策略來增強蛋白質組學深度，從而能夠識別區(qū)分良惡性肺結節(jié)的關鍵生物標志物。雖然這些研究強調了開發(fā)創(chuàng)新工作流程以增強血清蛋白質組學的重要性，但重要的是要認識到 PC 分析中的分散工作流程，加上由于非標準化方案而導致的核心設施之間的差異，可能會引入不一致，從而破壞生物標志物發(fā)現的可靠性，并可能導致誤解。

基于 MS 的生物標志物發(fā)現中的潛在陷阱

用于生物標志物發(fā)現的 NPs PC 分析面臨重大挑戰(zhàn)，部分原因是動態(tài)范圍寬（即 22 種蛋白質占血漿蛋白重量的 99%），以及血漿中存在不同的蛋白質亞型。此外，從軟 PC 到硬 PC 的轉變涉及競爭性吸附，并受幾個關鍵參數的影響，包括蛋白質濃度、結合親和力和 NP 的物理化學性質。在這方面，由于 NPs 表面 PC 形成的動態(tài)性質，NPs 的PC 具有富集人血漿蛋白質組的潛力。在生物標志物發(fā)現中，PC 的關鍵方面之一是低豐度生物標志物的富集，這些生物標志物以非常低的濃度存在于人血漿中，并且可以在 PC 層中富集。這種富集有助于檢測和鑒定可能難以直接從復雜生物基質中檢測的稀有生物標志物。除了 NP 的物理化學性質外，生物液體中存在的代謝物、脂質、維生素和其他類型的小生物分子還可以與這些液體中的蛋白質相互作用并影響它們的行為，包括它們對 NP 的吸附并產生獨特的 PC 模式。最近報道，高水平的膽固醇作為涉及各種人類疾病（例如心血管疾?。┑闹匾x物，由于在膽固醇存在下蛋白質與 NPs 的結合親和力發(fā)生變化，導致 PC 富含載脂蛋白和減少補體蛋白。在解決 NPs 的PC 的復雜性時，我們之前證明，調節(jié) PC 組成可顯著提高血漿蛋白質組的檢測深度，從而能夠捕獲具有高診斷價值的稀有和低豐度蛋白質。

       在這方面，NP的 PC 等新興技術對于降低生物標志物發(fā)現中給定生物流體的生物復雜性至關重要。然而，鑒定穩(wěn)定且可重現的 PC 組成和/或蛋白質生物標志物在很大程度上取決于 MS 工作流程。例如，最近的研究結果表明，當使用不同的方法、方案、LC-MS/MS 儀器和原始數據處理時，相同的 NP的 PC 結果在不同的蛋白質組學中心中表現出顯著的異質性，并且無法在獨立研究中輕松比較 PC 結果。當生物標志物結果的可重復性是一個持續(xù)的挑戰(zhàn)時，這是臨床領域的一個關鍵問題。換句話說，在一項 PC 研究中發(fā)現的蛋白質/生物標志物在后續(xù)調查中或應用于不同的患者群體時不一定有效。因此，迫切需要開發(fā)一種獨特的 PC 分析集中式標準方案，以最大限度地減少最終可用于臨床應用的 PC 結果的異質性。Zhang 等人最近發(fā)表的方案概述了在生物和環(huán)境背景下對 NP 進行 PC 分析的綜合框架。雖然研究的重點是為不同系統(tǒng)的 PC 分析開發(fā)通用工作流程，但我們的研究強調了分散式工作流程對使用 LC-MS/MS 進行 PC 表征的影響，以及這些復雜性如何誤導生物標志物的發(fā)現。我們專門解決了由非標準化方案引起的核心設施和蛋白質組學中心之間的變異性問題，這一挑戰(zhàn)迄今為止尚未得到充分承認。

這里的主要重點是解決與分析 NP 的硬 PC 相關的挑戰(zhàn)。雖然 LC-MS/MS 是一種強大的技術，可為硬 PC 分析提供高靈敏度和特異性，但當應用于 NP 的軟 PC 時，它存在明顯的局限性。質譜分析所需的凈化過程通常會破壞 NP 的微妙平衡，導致形成軟 PC 的松散結合蛋白質丟失。這損害了準確區(qū)分軟 PC 層和硬 PC 層的能力。盡管已經開發(fā)了先進的技術，如場流分離、基于原位生物膜干涉測量法 （BLI） 的捕撈策略、多參數表面等離子體共振 （MP-SPR Navi? LayerSolver?） 和熒光相關光譜 （FCS），用于原位研究軟 PC 的形成，但這些方法通常難以有效地將軟 PC 與硬 PC 隔離或緩解污染和動態(tài)等問題變異性。此外，離心是分離 PC 包被的 NP 的最廣泛使用的方法，在這方面尤其有限，因為它主要分離硬 PC，而由松散連接的蛋白質組成的軟 PC 通常會在此過程中丟失。因此，分離和研究軟 PC 仍然是一項重大挑戰(zhàn)，需要創(chuàng)新的實驗方法來解決其脆弱性以及下游 LC-MS/MS 分析帶來的額外復雜性。

不當行為的來源

使用 MS 進行 PC 分析和生物標志物發(fā)現的整個程序包括三個核心階段，包括樣品制備、使用 LC-MS/MS 系統(tǒng)進行測量和數據分析。第一階段的樣品制備有幾個核心步驟，例如蛋白質濃度測量、變性、還原、烷基化、蛋白質消化和脫鹽/清潔，乍一看似乎相對簡單，如圖2所示。然而，這可能只是冰山一角，這些步驟中的每一個都有其他幾個多步驟，其中包含許多實驗和技術細節(jié)，這些細節(jié)可能因核心設施而異（在圖2中示意性地顯示為冰山深度），并且在 PC 分析過程中需要仔細考慮以發(fā)現生物標志物。例如，最近表明，在 NP 的 PC 分析期間，各個蛋白質組學中心在樣品制備、儀器、定量方法、搜索參數以及原始數據處理和報告方面存在許多差異，這導致最終相同 NP 的 PC 結果存在顯著差異（即，美國 17 個蛋白質組學中心之間只有 1.8% 的共享蛋白質）這些變化從最初的蛋白質消化步驟開始，一直持續(xù)到分析的最新步驟（例如，原始數據處理），一旦積累，最終會導致最終結果的復雜分歧和數據不一致，如下所示

圖 2.使用質譜法對看似簡單的 NP PC 分析背后的復雜性的示意圖。

該圖強調，雖然分析 NP 的 PC 組成的工作流程可能看起來很簡單，但它只是“冰山一角”。表面之下隱藏著顯著的復雜性，包括不同的樣品制備方法、LC-MS/MS工作流程的變化（例如，儀器、色譜和質量分析儀）以及數據庫搜索參數（例如，PTM和錯誤發(fā)現率（FDR））。這些因素在蛋白質鑒定中引入了巨大的可變性，可能會影響關鍵的納米醫(yī)學應用，例如生物標志物發(fā)現，在這些應用中，研究的一致性和可重復性至關重要。（縮寫：二辛可寧酸 （BCA）、紫外可見光譜 （UV-Vis）、熒光 （Fluorom）、二硫蘇糖醇 （DTT）、三（2-羧乙基）膦 （TCEP）、β-巰基乙醇 （β-ME）、鹽酸胍 （GuHCl）、碳酸氫銨 （AMBIC）、甲酸 （FA）、十二烷基硫酸鈉 （SDS）、二硫蘇糖醇 （DTT）;碘乙酰胺 （IAA）;N-乙基馬來酰亞胺 （NEM）、氯乙酰胺 （chloro）;N-甲基硫代苯磺酰胺 （NMTS）;胰凝乳蛋白酶 （Chymotry）， Glu-C （V8 蛋白酶） （Glu-C）， 半制備流式 （semi-prep）;制備液程 （preparat））。

樣品制備

使用 LC-MS/MS 進行 NP PC 分析時，樣品制備和蛋白質消化成肽是關鍵步驟。兩種廣泛使用的酶解技術是磁珠上酶解和凝膠內酶解，根據樣品類型、復雜性和所需結果，每種技術都具有獨特的優(yōu)勢和局限性。例如，一些蛋白質組學中心從磁珠開始，而一些蛋白質組學中心使用凝膠內消化方法，這兩種起始方法在多大程度上影響了最終結果的差異，在很大程度上仍然未知。使用聚丙烯酰胺凝膠對不同的、分子量分離的蛋白質條帶進行測序，增強了分析蛋白質混合物的動態(tài)范圍，并允許在較寬的豐度范圍內檢測蛋白質，因為每個條帶的凝膠內胰蛋白酶消化產生的肽都是單獨測序。例如，將蛋白質組分布在 10-20 個凝膠切片中可顯著提高分析深度，從而鑒定出更多蛋白質并檢測適合分析復雜混合物的 PTM。此外，凝膠電泳可有效去除低分子量污染物，例如去污劑和緩沖液組分，這些污染物會阻礙質譜測序 。

另一方面，在磁珠上消化中，蛋白質與磁珠（例如磁珠或瓊脂糖磁珠）結合，并直接在磁珠表面消化，無需事先洗脫。磁珠上消化具有更快的制備過程（即蛋白質直接在磁珠上消化）、更簡單的工作流程、減少樣品損失并提高通量的優(yōu)勢。此外，磁珠上消化可有效捕獲低豐度蛋白質，尤其是在親和純化實驗中，其中目標蛋白質已經富集。然而，磁珠上消化方案的蛋白質覆蓋率較低，這些蛋白質難以溶解或在與磁珠結合時受到空間位阻，這可能導致消化不完全。此外，磁珠上消化對于靶向蛋白質研究更有效、更直接，尤其是在親和純化設置中，而凝膠內消化提供更好的蛋白質分辨率，可用于分析復雜樣品。

Table 1. Comparison of on-bead and in-gel digestion methods for proteomic analysis of PC-coated NPs.

此外，許多蛋白質組學中心使用二硫蘇糖醇 （DTT） 或 β-巰基乙醇 （β-ME） 在變性后破壞蛋白質內的二硫鍵，這有助于防止蛋白質聚集并保持蛋白質處于變性狀態(tài)。然而，一些蛋白質組學中心跳過了這些關鍵的制備步驟和/或對 DTT 和 β-ME 分別使用 1 mM 至 10 mM 和 1–10 % 的不同濃度。IAA（典型濃度為 5 mM 至 50 mM）是最常見的烷化劑之一，可與游離半胱氨酸殘基反應，從而防止樣品制備過程中二硫鍵的重組。一些核心設施也可能單獨或組合使用三氟乙酸 （TFA） 和 FA，具體取決于實驗的具體要求和被分析蛋白質的性質。與此同時，許多用于 NP PC 分析的可用方案可能會忽略這些步驟，而只是從胰蛋白酶消化開始幾個小時來消化蛋白質。

胰蛋白酶處理是樣品制備中的關鍵步驟之一，在確定 LC-MS/MS 中蛋白質鑒定的效率和結果方面起著至關重要的作用。優(yōu)化胰蛋白酶處理條件對于提高 LC-MS/MS 中蛋白質鑒定的水平至關重要，因為它會影響酶解效率、肽產量和 PTM 保存。關鍵因素包括酶與底物的比例、消化時間、溫度、pH 值和添加劑。例如，高酶蛋白比值和長時間消化會增加切割，但可能導致過度消化和非特異性肽，而低比例或短消化時間則存在不完全切割的風險。而不同的蛋白質組學中心使用各種類型的胰蛋白酶和廣泛的溫度和孵育時間進行蛋白質消化，這可能會影響蛋白質切割。酶特異性、活性和切割效率的這種變化會顯著影響生成的肽的數量和類型。例如，據報道，牛胰蛋白酶產生更多缺失切割的肽，而豬胰蛋白酶產生更多的半胰蛋白酶肽。此外，在幾個切割位點觀察到消化動力學的差異，這從 2 小時和 18 小時消化之間肽豐度的變化中可以看出。

此外，清潔和脫鹽條件還通過去除污染物、鹽和其他干擾物質來顯著影響蛋白質鑒定，這些物質會抑制電離、降低靈敏度和模糊肽信號。LC-MS/MS 樣品制備中節(jié)省成本的清潔方法，例如減少脫鹽步驟、重復使用低質量固相萃取 （SPE） 色譜柱、沉淀后進行最少的清洗或使用不正確的透析膜，可能會對蛋白質鑒定產生負面影響。例如，Thermo Fisher Scientific 的一項研究比較了四種 MS 樣品制備方法：Pierce 試劑盒、過濾輔助樣品制備 （FASP）、AMBIC/SDS 和尿素萃取，發(fā)現 Pierce 試劑盒方案（包括 C18 脫鹽步驟）可鑒定出最多的獨特肽和蛋白質，以及最低的漏缺切割百分比。例如，與磁珠上或凝膠內消化等傳統(tǒng)方法不同，FASP 使用基于過濾的方法將樣品凈化和酶消化相結合。FASP 對于處理復雜的生物樣品（如血清、血漿或細胞裂解物）特別有效，可提高肽回收率并最大限度地減少污染。它簡化了工作流程，提高了可重復性，并能夠高效處理難以溶解的蛋白質。與磁珠上和凝膠內消化方法相比，FASP 提供了一種簡化、無污染的方法，非常適合高通量研究，使其成為現代蛋白質組學中的關鍵工具。然而，由于離心步驟多，它可能非常耗時，并且可能需要優(yōu)化以防止低豐度蛋白質的損失。因此，適當平衡的脫鹽方法可以確保高肽回收率、最低污染和最佳信號質量，這對于在 LC-MS/MS 中準確且可重現地鑒定蛋白質至關重要。

儀器

樣品制備后，LC 和 MS 儀器的選擇以及相應的工作流程是第二個關鍵步驟，在確定蛋白質鑒定的深度和準確性方面起著至關重要的作用。關鍵因素包括色譜柱類型和粒徑，其中高分辨率色譜柱可增強分離效果，但會增加運行時間和分析成本，而標準色譜柱可能有助于鑒定高豐度蛋白質。此外，色譜規(guī)模起著至關重要的作用，納質譜相色譜對低豐度蛋白質的靈敏度更高，而標準液相色譜更穩(wěn)定，但靈敏度較低。此外，較長的梯度可改善復雜蛋白質的分離，但較短的梯度會耗費時間，并且較短的梯度可能會引入共洗脫，因此更適合豐度肽。此外，多維液相色譜（如 2D-LC 或分級分離）提高了蛋白質組覆蓋率，但需要大量的設置，而單維液相色譜速度更快，但不太全面。除了影響靈敏度和回收率的樣品上樣和進樣方法（例如，直接進樣與捕集洗脫法）外，流動相組成的其他幾個參數（例如緩沖液選擇和 pH 控制）也可能影響肽保留。

液相色譜分離后，質譜儀首先測量完整肽（母離子）的質荷比 （m/z）。然后，選定的肽通過碰撞誘導解離 （CID）、高能碰撞解離 （HCD） 或電子轉移解離 （ETD） 等技術進行碎裂，將母離子分解成更小的碎離子以進行詳細分析。每種碎裂方法都會影響可檢測、鑒定和定量的肽的范圍和類型，從而對生物標志物的發(fā)現產生獨特的影響。不同的質量分析器（例如 orbitrap、Time of Flight （TOF） 或離子阱）的分辨率和靈敏度不同，影響了低豐度蛋白質的檢測，而低豐度蛋白質通常是關鍵的生物標志物。例如，高分辨率質量分析器（例如 orbitrap）可提供低豐度肽的精確鑒定和詳細的 PTM 表征;它可能適用于復雜樣品中豐度較高的蛋白質。雖然低分辨率質量分析儀（例如離子阱）更實惠、更快速，但分辨率可能有限，這反過來會阻礙密切相關的肽和低豐度蛋白質的檢測，從而可能偏倚生物標志物的發(fā)現。因此，在復雜樣品（如 PC 包被的 NP）中，選擇正確的碎裂技術或結合多種方法可以減少這種偏差，有助于確保更全面、更準確的生物標志物譜。

數據分析

最后一個階段會顯著促進蛋白質和肽的鑒定，并在生物標志物發(fā)現中產生偏差，即用于 LC-MS/MS 原始數據處理和分析的方法和途徑。這些關鍵步驟包括但不限于數據預處理算法、識別閾值和數據庫搜索、定量方法（例如，無標記和標記定量）、歸一化和縮放技術、統(tǒng)計分析和顯著性閾值、生物信息學和通路分析工具。例如，用于降噪、峰拾取和對齊的數據預處理方法會影響保留或丟棄哪些信號，從而在原始 LC-MS/MS 數據分析過程中產生蛋白質鑒定偏差。靈敏度較低或過于激進的預處理可能會消除低強度信號，并可能影響低豐度肽的檢測，這些肽通常是關鍵的生物標志物。嚴格的篩選標準和參考數據庫的選擇（例如 Uniport 和 Proteome Discoverer）會影響蛋白質鑒定。最近表明，實施標準化數據庫搜索提高了可重復性，將不同設施之間的一致蛋白質鑒定從 1.8% 提高到 35.3%，并強調了標準集中式方案在 NP 的 PC 分析中用于納米醫(yī)學應用的重要性。

過于嚴格的閾值可能會遺漏低置信度的肽段，而不太嚴格的設置可能會導致假陽性。此外，數據庫的限制可能導致對特征明確的蛋白質的偏見，可能會忽略新的生物標志物。由于電離效率和重現性的可變性，無標記定量可能偏向于高豐度蛋白質，而標記方法（例如，TMT 或細胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記 （SILAC））提供了更好的相對定量，但成本高昂且多重檢測能力有限。定量方法的選擇會影響低豐度生物標志物的檢測和差異表達分析的準確性。此外，用于歸一化和縮放數據的方法（例如，總離子電流和中位歸一化）會影響相對豐度計算，這可能會偏向于某些蛋白質/肽或樣品類型，從而使生物標志物的發(fā)現產生偏差。換句話說，不適當的標準化可能會放大技術差異或掩蓋生物學相關的變化。此外，統(tǒng)計閾值和分析方法用于確定蛋白質水平的顯著變化會影響哪些蛋白質/肽被標記為潛在的生物標志物。事實上，過于傳統(tǒng)的閾值可能會錯過微小但重要的生物變化，而靈活的設置可能會導致假陽性和不準確的生物標志物譜。此外，用于解釋數據的生物信息學工具在生物標志物選擇中起著至關重要的作用。一些工具是針對特定的蛋白質家族或通路量身定制的，這可能導致偏向于某些生物過程，可能會忽略可能作為潛在診斷生物標志物的不太明確的蛋白質。

展望 – 我們如何彌合 NPs PC 分析的差距？

為了解決在納米生物界面進行 LC-MS/MS 分析過程中 NP PC 結果的不一致性和不可重復性，我們提出了三項關鍵行動，包括：（i） 標準化樣品制備和蛋白質消化方案，（ii） 協(xié)調 LC-MS/MS 儀器和工作流程，以及 （iii） 實施統(tǒng)一的數據處理。使用標準作方案，尤其是在各種消化步驟中，對于可靠和可重復的 NP 的 PC 結果至關重要。通過統(tǒng)一蛋白質濃度測量技術（例如，僅 BCA 方法）、一致的方案步驟（包括預酶解還原和烷基化）、使用一致的添加劑（即化學品/材料）（如變性劑和還原劑）、酶（例如胰蛋白酶）和酶蛋白比（例如，1：50）、酶解時間（例如，18 小時）、溫度（37 °C）等，實驗室可以最大限度地減少肽回收和蛋白質鑒定的差異。這種標準化使得在獨立研究中輕松比較 PC 結果，并提高蛋白質定量和生物標志物發(fā)現工作的準確性。

在標準化 LC-MS/MS 儀器中，建議使用類似類型的 LC 和 MS 儀器，以減少分析之間的不一致。同步 LC-MS/MS 儀器和設置（如質量分辨率、電離模式、碎裂方法等）也很重要，以確保研究之間的重現性，這對于更廣泛的納米醫(yī)學應用至關重要。在系統(tǒng)式 LC-MS/MS 儀器中，應統(tǒng)一設置不同儀器的質量分辨率（例如，在 Orbitrap 系統(tǒng)上為 60,000 或更高），并且電離模式也應保持一致（例如，肽分析為陽性，磷蛋白為陰性）。應根據樣品類型選擇碎裂方法（即 HCD 或 CID）（例如，用于肽鑒定的 HCD 具有 30–35% 的歸一化碰撞能量）。此外，校準程序和內標（例如用濃度為 50 fmol/μL 的重標記肽加標樣品）有助于對齊儀器響應，確保整個實驗中的準確定量。

在用于 NP PC 分析的統(tǒng)一原始 LC-MS/MS 數據處理中，關鍵考慮因素可能包括標準化峰拾取、降噪和對齊算法，以確保在相同樣品中對肽的一致檢測。應用統(tǒng)一的 FDR 閾值（例如 1 %）進行蛋白質鑒定可減少假陽性，而一致的歸一化和定量方法可確保蛋白質豐度的可比性。此外，使用標準數據庫（例如，Maxquant 或蛋白質組發(fā)現器）和統(tǒng)一的搜索參數，例如可變修飾（例如，M 氧化、蛋白質 N 末端的乙?；⑻於０返拿擋０?、脲甲基化等）和允許的漏缺切割（例如，最多 2 個）在很大程度上最大限度地減少了最終結果的可變性。這些步驟相結合提高了可重復性，減少了偏倚，并增強了 NP PC 研究中生物標志物發(fā)現的可靠性。

由于 NP 表面的蛋白質持續(xù)吸附和解吸，捕獲 PC 組成的動態(tài)變化仍然是一項重大挑戰(zhàn)。雖然目前的檢測方法（如 LC-MS/MS）僅提供蛋白冠的靜態(tài)快照，但研究人員一直在探索實時監(jiān)測技術，以更好地了解 PC 在 NP 表面上的動態(tài)形成。通過散射顯微鏡進行實時光學納米顆粒分析 （RONAS） 和表面等離子體共振顯微鏡 （SPRM） 等方法能夠對蛋白質吸附和解吸進行動力學跟蹤。此外，片上電氣監(jiān)控技術可實時對軟硬 PC 進行無標記觀察。此外，場流分離 （FFF） 已成為 PC 原位分析的寶貴工具。FFF 允許溫和分離 NPs 及其相關的 PC，而不會破壞所涉及的復雜平衡。這些進步為蛋白冠動力學提供了有價值的見解，對納米醫(yī)學應用和生物標志物發(fā)現具有重要意義。另一方面，將人工智能 （AI） 整合到 PC 分析中，在克服單一檢測方法的局限性方面具有巨大潛力。機器學習模型可以通過預測 PC 形成、跟蹤動態(tài)變化和提高 PC 成分分析的準確性來增強實時監(jiān)控。來自質譜、SPR 和散射顯微鏡等多種技術的 AI 驅動數據集成可以更全面地了解 PC 動力學。然而，挑戰(zhàn)仍然存在，包括需要高質量的訓練數據集、分析方法的標準化以及在復雜生物環(huán)境中驗證 AI 預測。

總之，雖然質譜法對于在 NP 的 PC 研究中鑒定疾病特異性蛋白質非常有價值，但必須仔細注意方法學陷阱，因為它可能會引入方法學不一致的重大風險，從而導致生物標志物發(fā)現中的錯誤行為。通過標準化方案、儀器和嚴格的數據處理來應對這些挑戰(zhàn)，將提高基于 MS 的 PC 分析的可靠性，并在生物標志物發(fā)現研究中提供更準確和可重現的結果。廈門普睿邁格生物科技有限公司提供低豐度蛋白富集磁珠http://www.5000js.com/Product/8096211554.html