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1.如何盡量避免蛋白表達(dá)過(guò)程中包涵體的形成？

(1). 包涵體的形成很大一部分原因是蛋白表達(dá)過(guò)快引起的，那么降低誘導(dǎo)溫度，例如25–30°C，或降低IPTG濃度(0.01–0.1mM)并延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，或者換用作用較弱的啟動(dòng)子，以此來(lái)減緩表達(dá)的速度
(2). 用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基來(lái)替換IPTG誘導(dǎo)
(3). 攜帶大標(biāo)簽如GST、 TrX共表達(dá)來(lái)增加可溶性
(4). 分子伴侶

2.包涵體純化包括哪些步驟？

(1) 菌體的破碎：首先通過(guò)細(xì)菌裂解離心得到粗制包涵體；
(2) 包涵體的洗滌：然后使用含有低濃度變性劑（如2M尿素）或不含變性劑的緩沖液清洗包涵體，去除一部分雜蛋白，通過(guò)離心得到精制包涵體；
(3) 溶解：再使用含有高濃度變性劑（如8M尿素或6M鹽酸胍）的緩沖液對(duì)精制包涵體進(jìn)行溶解；
(4) 復(fù)性以及純化：復(fù)性操作方式主要分為稀釋、透析和柱上復(fù)性，可以先純化再?gòu)?fù)性，也可以先復(fù)性再純化；而柱上復(fù)性是在蛋白復(fù)性的過(guò)程中即對(duì)蛋白進(jìn)行純化；
(5) 檢測(cè)分析：最后，對(duì)得到的樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，看是否得到天然態(tài)的蛋白。

3.包涵體蛋白復(fù)性效率低的原因是什么？

(1). 復(fù)性環(huán)境與復(fù)性過(guò)程不匹配
(2). 缺少必要的分子伴侶和折疊酶
(3). 中間體裸露的殘基容易彼此結(jié)合

4.6M的鹽酸胍溶解包涵體，然后用SDS-PAGE檢測(cè)，跑膠很慢是什么情況？

鹽酸胍樣品的離子強(qiáng)度很高，而離子濃度對(duì)局部的電流肯定影響比較大，用8M Urea 10倍稀釋鹽酸胍包含體增溶液，再試試

5.復(fù)性好的蛋白透析更換緩沖液時(shí)，蛋白都析出怎么辦？

(1). 可能會(huì)是梯度透析間隔時(shí)間太短，試著加長(zhǎng)一下每次更換溶液的間隔時(shí)間。
(2). 要是目標(biāo)蛋白中含有二硫鍵的話，透析液中也必須添加一定比例的GSSG/GSH以協(xié)助二硫鍵的正確形成，這在蛋白質(zhì)重折疊過(guò)程中是至關(guān)重要的。
(3). NaCl的濃度可再加大一點(diǎn)，因?yàn)樗彩菂f(xié)助復(fù)性過(guò)程中常用的復(fù)性添加劑。
(4). 實(shí)在不行的話，可能還要想辦法向透析液中加入其它能夠抑制聚集同時(shí)協(xié)助復(fù)性的其它添加劑，如L-Arg、有機(jī)溶劑、PEG等。

6.變性劑（離液劑），去垢劑，表面活性劑溶解包涵體的分子原理分別是什么？

  強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），是通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來(lái)講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性pH值下長(zhǎng)期保溫時(shí)。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒(méi)有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。

7.變性的融合蛋白可以制備多抗或者單抗嗎？

  變性蛋白的本質(zhì)還是天然蛋白，用來(lái)免疫動(dòng)物具有更強(qiáng)的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決 定簇也會(huì)暴露出來(lái)，如果用該變性抗原制備的抗體來(lái)檢測(cè)變性抗原是可以的，如果用來(lái)檢測(cè)天然蛋白，可能會(huì) 有假陽(yáng)性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對(duì)抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還 要看將來(lái)該單抗的用途。

8.包涵體蛋白制備抗體需要復(fù)性嗎?

  做抗原得到蛋白的話不需要復(fù)性。包涵體蛋白就可以了。因?yàn)榭贵w是針對(duì)蛋白表位的（各個(gè)肽段），而不是功能。
  除了一種情況就是蛋白空間構(gòu)象導(dǎo)致某些表位的產(chǎn)生，但是這個(gè)情況特殊的很，通常情況不需要考慮的。

9.包涵體純化后收率很低，如何優(yōu)化？

  蛋白復(fù)性后濃度低，可能是在復(fù)性的過(guò)程中發(fā)生了降解?？梢詫?fù)性好的蛋白濃縮跑膠看看。影響蛋白折疊收率的因素有溫度、添加劑和氧化還原劑：
  溫度：高溫時(shí)復(fù)性的速率比較高，但是易于發(fā)生聚集，一般建議復(fù)性的起始溫度可以嘗試15℃；添加劑：添加劑可以促進(jìn)結(jié)構(gòu)形成，增強(qiáng)蛋白之間的相互作用，提高溶解性，抑制聚集體的形成，降低側(cè)鏈的相互作用，如去垢劑，精氨酸，低濃度的尿素和鹽酸胍，PEG等；氧化還原劑：對(duì)于需要形成二硫鍵的蛋白來(lái)說(shuō)，還需要使用一些氧化還原劑，幫助復(fù)性，形成正確的二硫鍵，常用的還原劑如DTT，β-ME等。
  包涵體復(fù)性是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，受諸多因素的制約。實(shí)驗(yàn)中各種試劑和蛋白質(zhì)的濃度、操作溫度和復(fù)性時(shí)間、緩沖液的成分和pH值等因素都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著至關(guān)重要的作用。精確掌握每一個(gè)因素，才能獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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