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一、概述
NHS 活化的瓊脂糖磁珠（Magarose-NHS）將蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單有效地共價(jià)固定到磁珠載體上，為抗體、抗原或其他生物分子的親和純化提供了有價(jià)值的方法。活化的瓊脂糖磁珠含有能夠與蛋白質(zhì)或其他分子上的伯胺反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵的 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）官能團(tuán)。耦合反應(yīng)在 pH 7~9 的無胺緩沖液中進(jìn)行。不管配體的分子量或等電點(diǎn)（PI）耦合反應(yīng)的效率均大于 80%。一旦配體被固定，所制備的瓊脂糖磁珠即可以被應(yīng)用到多重親和純化程序中。
二、產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱
Magarose-NHS
貨號(hào)
PMAG017
磁珠濃度
25% (v/v) in 100% 異丙醇
配基密度
~ 50 μmol NHS/ ml磁珠
介質(zhì)
6%交聯(lián)磁性瓊脂糖
粒徑
20-45μm
配體結(jié)合
>20 mg IgG/ml磁珠
保存
2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白結(jié)合量與目標(biāo)蛋白特性相關(guān)，此處僅作參考值。
三、使用方法
1. 緩沖液
所有的水和緩沖液均用 0.22 μm 或 0.45 μm 的濾膜進(jìn)行過濾。
① Washing Buffer A: 1 mM 鹽酸，使用前冷卻到 4oC;
② Coupling Buffer A: 100 mM 2-嗎啉乙磺酸 MES，pH 4.8（用于等電點(diǎn)小于 7 的生物分子的偶聯(lián)）;
③ Coupling Buffer B: 200 mM NaHCO3， pH 8.3（用于等電點(diǎn)大于 7 的生物分子的偶聯(lián)）;
④ Blocking Buffer: 3 M 乙醇胺，pH 9.0;
⑤ Storage Buffer: 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.05%疊氮化鈉的 PBS 緩沖液或者根據(jù)客戶自己需求采用其他緩沖液。
2. 流程關(guān)鍵點(diǎn)
1) 其中磁珠洗滌要嚴(yán)格按照說明書采用冷卻的 Washing Buffer A（①）快速洗滌 ，以防磁珠在洗滌過程中 NHS 基團(tuán)水解；
2) 蛋白偶聯(lián)過程中，首先要通過實(shí)驗(yàn)確定合適的 Coupling Buffer（主要包括 Coupling Buffer A（②）、Coupling Buffer B（③）、50 mM 硼酸溶液pH 8.5、100mM磷酸緩沖液，100mM NaCl，pH7.4這四種）；
3) 確定合適的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer 為基礎(chǔ)，確定合適的偶聯(lián)蛋白濃度，因?yàn)榈鞍诐舛仍礁撸悸?lián)到磁珠上的蛋白的量會(huì)越大（這是由于 NHS 基團(tuán)跟蛋白偶聯(lián)和 NHS 基團(tuán)本身水解是一對(duì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)）。當(dāng)然此處要綜合考慮使用性能和成本，有些客戶偶聯(lián)少量的蛋白便可滿足使用需求，這時(shí)采用低濃度的蛋白便可，這樣可以降低成本。
4) 封閉這一步可以采用3 M 乙醇胺，也可使用 Tris 緩沖液（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0），封閉時(shí)間不得低于 2 h，如果化學(xué)封閉后背景仍然很高，還可以額外加一步 BSA 封閉。
3. 蛋白偶聯(lián)操作步驟
以下操作過程以取磁珠樣品 400 μL，采用 1.5 mL EP 管為例介紹。用戶可根據(jù)自身需求按比例調(diào)整。
蛋白溶液配制：取適量待偶聯(lián)蛋白用 Coupling Buffer 溶解，配成濃度為≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液。已經(jīng)保存于 buffer中的蛋白，需要通過透析或者脫鹽的方法徹底除去原有 buffer 里含伯胺基的物質(zhì)，然后再用 Coupling Buffer 配成濃度為≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液，將配制好的蛋白溶液于4℃保存?zhèn)溆谩?
注： (1)為達(dá)到更好的性能，蛋白濃度≥3.0 mg/mL，這樣偶聯(lián)效率會(huì)更高，此處需綜合考慮成本和使用要求； (2)蛋白溶液中不能含有帶伯氨基的成分，比如 Tris，甘氨酸，明膠，BSA 等；
1) 取 400 μL 25%磁珠懸浮液于 1.5 mL EP 管中。磁分離，去除上清液。
注：磁珠取樣前要反復(fù)顛倒、使用渦旋振蕩器使其混合均勻，以保證實(shí)驗(yàn)的同一性，每取一次樣需要重新混勻。
2) 加 1 mL 2~8℃的 Washing Buffer A（①）于離心管中，渦旋 15 s，使磁珠混合均勻。將 EP 管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，去除上清液。
3) 加 200 μL 蛋白溶液于 EP 管中，渦旋 30 s，使其混合均勻。
注：磁珠洗滌后要立即加入蛋白溶液。
4) 將 EP 管渦旋 15 s，置于垂直混合儀上，室溫混合 2~4 h。如果垂直混合不均勻，則反應(yīng)前 30 min，每隔5 min 取下 EP 管渦旋 15 s。此后，每隔 15 min，取下 EP 管渦旋 15 s。
注：如有需要可以在 4oC 反應(yīng)過夜。
5) 采用磁性分離架富集磁珠，保存上清。加 1 mL Blocking Buffer（④）于 EP 管中，渦旋 30 s，將 EP 管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。
注：Blocking Buffer（④）除了試劑盒中提供的 3 M 乙醇胺外，也可以使用 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0 等其它封端試劑。
6) 加 1 mL Blocking Buffer（④）于 EP 管中，渦旋 30 s，將 EP 管置垂直混合儀中室溫反應(yīng)2 h。將 EP 管置于磁性分離架內(nèi)，富集磁珠，棄上清液。
7) 加 1 mL 超純水于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。
8) 加 1 mL Storage Buffer（⑤）（比如含 0.05%疊氮化鈉的 PBS 緩沖液，或者客戶根據(jù)自己實(shí)際需求選合適的保存溶液 ）于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。重復(fù)該操作 2 次。
9) 加入 400 μL Storage Buffer（⑤）于 EP 管中，充分混合，4oC 保存?zhèn)溆谩?
注：最終偶聯(lián)蛋白的磁珠濃度為 25% (v/v)。
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