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貨號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
PMG-ConA001-1mL
PuriMag? Concanavalin A Magnetic Beads （刀豆素A磁珠）
1mL×1
PMG-ConA005-5mL
5mL×1
保存條件： 4oC保存，兩年有效。
一．產(chǎn)品簡(jiǎn)介
2 PuriMag? Concanavalin A Magnetic Beads，也稱Concanavalin A磁珠、ConA磁珠、刀豆素A磁珠、刀豆凝集素磁珠、伴刀豆球蛋白A磁珠，由高質(zhì)量的刀豆素A（Concanavalin A, ConA）與超順磁性納米磁珠共價(jià)偶聯(lián)而成，能夠快速、高效、靈敏、特異性地與糖蛋白、糖脂、多糖等帶有糖基化修飾分子結(jié)合。
2 Concanavalin A，簡(jiǎn)稱ConA或Con A，中文名為刀豆素A，又叫伴刀豆球蛋白A、刀豆蛋白A或刀豆凝集素A，是一種從Jack beans（Canavalia ensiformis）分離的甘露糖/葡萄糖結(jié)合凝集素，是使用最廣泛的凝集素之一，CAS號(hào)為11028-71-0，其單體的分子量約為25.5kDa，可結(jié)合一個(gè)Ca2+和一個(gè)Mn2+，含一個(gè)糖基結(jié)合部位，對(duì)末端α-D-甘露糖基和α-D-葡糖基殘基具高親和力。刀豆素A是一種T細(xì)胞有絲分裂原，可激活免疫系統(tǒng)，募集淋巴細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。除了促有絲分裂活性外，刀豆素A還可通過(guò)特定分子機(jī)制誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。據(jù)報(bào)道刀豆素A還可激活NFAT（Nuclear factor of activated T cells），而NFAT是轉(zhuǎn)錄因子家族，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和發(fā)揮免疫功能中起重要作用。當(dāng)pH在5.8~7.0之間時(shí)，刀豆素A以四聚體形式存在，在pH6.5或更低的條件下解離為二聚體，pH高于7.0時(shí)可形成更大的聚合體。
2 本產(chǎn)品對(duì)糖類具高度專一識(shí)別能力，可特異性結(jié)合糖類，用于分離細(xì)胞、細(xì)胞核或糖蛋白等含有適當(dāng)糖基化修飾的分子，可直接用于CUT&RUN（Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease）等實(shí)驗(yàn)，獲得的糖基化蛋白可用于Western、質(zhì)譜等的分析檢測(cè)。
2 本產(chǎn)品對(duì)糖類蛋白的結(jié)合量高，而且磁珠粒徑小，不易產(chǎn)生非特異吸附。本產(chǎn)品每毫升磁懸液含有≥1mg ConA，每個(gè)ConA蛋白具有4個(gè)糖基結(jié)合部位，每毫升磁懸液可結(jié)合≥1mg糖蛋白，可高效地進(jìn)行細(xì)胞或糖蛋白等的分離純化等實(shí)驗(yàn)。
2 本產(chǎn)品所使用的納米級(jí)磁珠具有超大比表面積，有效縮短了ConA與糖類結(jié)合所需的時(shí)間，避免在長(zhǎng)時(shí)間操作過(guò)程中糖蛋白的降解，有效保證了糖蛋白的活性及完整性。
2 本產(chǎn)品儲(chǔ)存在特殊保護(hù)液中，不含甘油，磁分離，無(wú)需離心。本產(chǎn)品不僅適用于少量樣本的檢測(cè)，也適用于高通量篩選的自動(dòng)化操作系統(tǒng)，不同操作方法之間一致性高。
二．主要技術(shù)指標(biāo)
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled protein
Concanavalin A
Isotype
IgG2b
M.W. of antibody
~102kDa (tetramer)
Protein concentration
≥ 1mg Concanavalin A per ml beads
Binding capacity
≥ 1mg glycan/glycoproteins per ml beads
Specificity
Glycan and glycoconjugates
Application
Isolating cells or glycoproteins, CUT&RUN
三．注意事項(xiàng)
l 本產(chǎn)品需維持pH 6-8，避免高速離心、干燥或凍存。
l 本產(chǎn)品使用前要顛倒若干次使磁珠混合均勻，混勻操作須輕柔，不宜劇烈渦旋震蕩等，避免ConA變性。
l 用于沉淀或純化時(shí)，建議設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照組。
l 待結(jié)合分子的類型、大小等都會(huì)影響結(jié)合效率，建議通過(guò)稀釋法確定每種具體應(yīng)用的磁珠用量，同時(shí)可考慮加大磁珠用量至待結(jié)合分子2-3倍摩爾量以確保結(jié)合充分。
l ConA需要Ca2+和Mn2+存在才能有活性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)避免使用含EDTA或其它金屬離子螯合劑的試劑。
l 糖蛋白樣品收集后宜盡快完成純化，并應(yīng)始終置于4oC或冰浴，以減緩糖蛋白降解。為有效抑制蛋白降解，可在蛋白樣品中添加適量蛋白酶抑制劑混合物，但各個(gè)蛋白酶抑制劑混合物中的EDTA不能添加。
l 與細(xì)胞孵育時(shí)ConA磁珠可能會(huì)發(fā)生聚集，屬于正?，F(xiàn)象，不影響磁珠的正常使用。
四．使用說(shuō)明
以下以純化糖蛋白或分離細(xì)胞為例，CUT&RUN實(shí)驗(yàn)需按照CUT&RUN的實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)備細(xì)胞和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1. 緩沖液的準(zhǔn)備
Binding Buffer：20mM Hepes(pH7.4), 150mM NaCl (optional), 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM CaCl2;
Wash Buffer：20mM Hepes(pH7.4), 150mM NaCl (optional), 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM CaCl2, 0.1% Tween-20;
Elution Buffer：5mM Tris(pH8.0), 150mM NaCl, 1M Glucose;
注1：使用PBS緩沖液可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，建議使用Hepes緩沖液。使用前，所有溶液平衡至室溫。Binding Buffer和Wash Buffer中的150mM NaCl都是可以選擇性添加的，如果用于CUT&RUN等對(duì)于細(xì)胞活力關(guān)系不大的實(shí)驗(yàn)，不推薦添加150mM NaCl；如果分離獲得的細(xì)胞后續(xù)用于細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞功能研究，建議添加150mM NaCl。不添加150mM NaCl時(shí)細(xì)胞結(jié)合和沉淀的效率更高，添加150mMNaCl時(shí)能更好維持細(xì)胞的滲透壓，使細(xì)胞處于更好的狀態(tài)。
注2：Elution Buffer需要根據(jù)糖蛋白的類型或糖蛋白與ConA磁珠的結(jié)合程度進(jìn)行一定的優(yōu)化。
注3：由于細(xì)胞與ConA磁珠結(jié)合的非常緊密，分離的細(xì)胞不建議使用本洗脫液進(jìn)行洗脫。
2. 樣品的準(zhǔn)備（其中細(xì)胞以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例）
a. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用20mM Hepes (pH7.5), 150mM NaCl洗滌細(xì)胞兩遍。按照6孔板每孔100-200μl胰酶的比例加入胰酶消化細(xì)胞。1-2分鐘后，加入20mM Hepes (pH7.5), 150mM NaCl重懸洗滌，400-500×g室溫離心5分鐘收集細(xì)胞。
b. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：400-500×g室溫離心5分鐘收集細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，然后用20mM Hepes (pH7.5), 150mM NaCl重懸洗滌，400-500×g室溫離心5分鐘收集細(xì)胞。
c. 細(xì)胞樣品的重懸：上述細(xì)胞樣品去除上清后，加入適量Binding Buffer重懸一次，取少量細(xì)胞懸液在顯微鏡下計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)為10,000-100,000，體積為500μl。根據(jù)計(jì)數(shù)計(jì)算每個(gè)樣品所需細(xì)胞懸液的體積，并用Binding Buffer對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋。
d. 對(duì)于細(xì)胞或組織裂解液或血清樣品：用Binding Buffer根據(jù)實(shí)際進(jìn)行一定的稀釋調(diào)整。
3. ConA磁珠準(zhǔn)備
a. 洗滌。由于ConA磁珠儲(chǔ)存在保護(hù)液中，使用前用適量10倍體積的Binding Buffer洗滌2次。
(a) 用移液器輕輕吹打重懸ConA磁珠，按照每200-500μl樣品使用10μl ConA磁珠懸濁液的比例，取適量ConA磁珠至一潔凈離心管中，加入10倍體積的Binding Buffer。
(b) 用移液器輕輕吹打重懸ConA磁珠。置于磁力架上分離10秒，去除上清。重復(fù)上述洗滌步驟一次。
b. 活化。按照ConA磁珠初始體積的量，用Binding Buffer重懸ConA磁珠。
注1：多個(gè)樣品時(shí)，取總磁珠量，合并洗滌處理后再平分到各個(gè)樣品中。
注2：活化好的磁珠應(yīng)當(dāng)天使用。
4. 樣品的結(jié)合、磁分離和洗滌
a. 孵育。加入適量樣品，用移液器重懸磁珠，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育10-30分鐘或4oC孵育4-16小時(shí)。
注1：孵育過(guò)程中，若ConA磁珠發(fā)生聚團(tuán)或呈片狀屬正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
注2：為了保證樣品完全結(jié)合到磁珠上，可加大ConA磁珠用量，并延長(zhǎng)孵育時(shí)間。
b. 磁分離。將離心管置于磁力架上分離1分鐘，去除上清。
c. 洗滌。取0.5ml的Wash Buffer加入分離得到的磁珠中，用移液器輕輕吹打重懸磁珠，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上洗滌5分鐘。將離心管置于磁力架上分離1分鐘，去除上清。重復(fù)洗滌3-4次。
5. 糖蛋白的洗脫
a. 每個(gè)樣品加入50-250μl Elution Buffer，混勻后置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育10-30分鐘。如果洗脫效果不佳，可重復(fù)洗脫一次，合并兩次洗脫液，或者增加孵育時(shí)間。
b. 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，所得上清為通過(guò)ConA磁珠分類純化獲得的糖蛋白。
c. 如果用于SDS-PAGE電泳或Western檢測(cè)，建議加入適量5×SDS-PAGE上樣緩沖液，95oC加熱5分鐘，然后置于磁力架上分離10秒，取上清進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
注1：需根據(jù)糖蛋白的類型或糖蛋白與ConA磁珠的結(jié)合程度對(duì)洗脫液進(jìn)行一定的優(yōu)化，或使用PNGase F酶進(jìn)行糖基的切除，從而使糖蛋白從磁珠上解離下來(lái)。
6. 細(xì)胞的洗脫
對(duì)于細(xì)胞，由于磁珠較小，基本不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性壓力，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性，理論上可不洗脫。
本產(chǎn)品僅供科研使用！
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