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MS-PRG001
1 ml
MS-PRG010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
蛋白G磁珠MagStart-Protein G是一種專有的磁性聚合物微粒，提供了一種簡單方便的抗體捕獲方法，適合后續(xù)各種靶分子富集，以及生物樣品中各種抗體/免疫球蛋白的高度特異性富集。MagStart磁珠是一種超多孔聚合物網(wǎng)絡(luò)，允許生物分子在整個微粒內(nèi)滲透和結(jié)合。MagStart-Protein G的高載量反過來又轉(zhuǎn)化為靶生物分子的極高結(jié)合量。與MagReSyn? Protein G有等同效果。
重組蛋白G（~32 kDa）與磁微粒共價連接，可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而有可能使蛋白質(zhì)在非標(biāo)準(zhǔn)條件下應(yīng)用。共價鍵有助于減少蛋白G從磁珠泄漏。MagStart蛋白G與其它市售蛋白G磁微粒相比有更出色的抗體結(jié)合能力，抗體純度高達97%以上，可舍去其它純化分離步驟。蛋白G磁珠的應(yīng)用包括血清樣品中的免疫球蛋白去除、抗體分離以及后續(xù)抗體靶標(biāo)免疫沉淀，用于下游應(yīng)用，例如：通過質(zhì)譜、免疫測定或電泳進行分析。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Isolation and purification of IgG molecules, Immunoprecipitation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Protein G (~32kDa)
Binding capacity
≥2.4 mg/ml IgG (Rabbit)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
15 mg/ml in TBS [50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.025% Tween? 20, 0.05% sodium azide (NaN3)]
Stability
pH 2~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當(dāng)儲存、微粒干燥、細菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
MagStart-Protein G微粒極高的官能團密度為生物分子偶聯(lián)提供了高濃度的反應(yīng)位點。MagStart-Protein G的高結(jié)合載量允許減少高活性功能微粒的體積來實現(xiàn)實驗方案小型化，進而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應(yīng)用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過磁壓縮減少了洗滌和洗脫過程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
2. 免疫球蛋白純化流程
可能影響抗體附著的因素包括免疫球蛋白的同種型、緩沖液組成和 pH 值，以及污染物/干擾化合物的存在。磁珠的數(shù)量需要針對每個單獨的應(yīng)用進行優(yōu)化。我們建議使用過量的配體來確保蛋白G磁珠的飽和度。結(jié)合效率可以通過比較偶聯(lián)前后的配體濃度來確定。MagStart-Protein G與各種常用緩沖液兼容，推薦的緩沖液包括：
結(jié)合/洗滌緩沖液 - TBS（pH 7.5, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.025% Tween 20）或 PBS（pH 7.5, 50 mM Phosphate, 150 mM NaCl，0.025% Tween 20）；
洗脫緩沖液（非變性）：0.1 M glycine，pH 2.5 或 2.5% acetic acid；
洗脫緩沖液（變性）：SDS-PAGE eletrophoresis buffer。
注意：所有試劑都應(yīng)是分析級且新鮮制備，以確保最佳性能。下面的程序、方法和緩沖液僅供參考，并非限制。MagStart-Protein G與一系列不同緩沖液兼容，用于結(jié)合抗體。可實現(xiàn)的純度和產(chǎn)率取決于配體，應(yīng)優(yōu)化實驗條件以確保獲得預(yù)期結(jié)果。
關(guān)于MS兼容性的注意事項：如要通過MS進一步分析富集的靶標(biāo)，請考慮在初始洗滌步驟后使用替代的無去垢劑緩沖液，以去除可能干擾MS分析的殘留去垢劑。這可能包括不加洗滌劑的初始緩沖液，然后用揮發(fā)性無鹽緩沖液（如碳酸氫銨、甲酸銨、三乙基碳酸氫銨）洗滌 2-3 次。
2.1. MagStart-Protein G磁珠的平衡
磁珠以15 mg/ml的TBS懸浮液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，0.025%Tween?20和0.05% NaN3作為防腐劑）的形式提供，適用于純化≥2.4 mg/ml的IgG（兔）。在使用前，需去除運輸溶液并在結(jié)合緩沖液中平衡磁珠。對蛋白G磁珠的等分試樣進行多重結(jié)合反應(yīng)，如下所述。每次反應(yīng)至少需要10μl的微粒懸浮液，以確保緩沖液的抽吸具有合適的顆粒尺寸。下面概述的結(jié)合和洗脫方案可作為示例，并可根據(jù)您的要求進行縮放。
1） 通過渦流混合或倒置徹底分散MagStart-Protein G磁珠，以確保均勻懸浮。
2） 轉(zhuǎn)移50μl 磁珠（足以捕獲約120μg兔IgG）到新的管中。
3） 磁分離，吸棄運輸溶液。
4） 加入300μl結(jié)合緩沖液（例如TBS或PBS）中洗滌/平衡磁珠，允許磁珠平衡至少1分鐘。
5） 將離心管放在磁分離器上，澄清后移液管吸棄結(jié)合緩沖液。
6） 重復(fù)步驟4和5兩次（總共3次洗滌）。
7） 從步驟6中去除結(jié)合緩沖液后，MagStart-Protein G準(zhǔn)備就緒，可用于結(jié)合靶免疫球蛋白。
2.2. 從血清或培養(yǎng)液中純化免疫球蛋白 (Ig)
1) 計算應(yīng)用所需的MagStart-Protein G磁珠的體積，并轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中。例如，50 μl 蛋白G磁珠（0.75 mg）足以結(jié)合 ≥ 120 μg 兔 IgG。
2) 用至少 90 μl 結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋 10 μl 樣品，渦旋攪拌 3 秒。樣品量可根據(jù)需要調(diào)整，但至少要用9份結(jié)合緩沖液來稀釋樣品（如，100 μl 樣品和900 μl 緩沖液可與 50 μl磁珠一起使用）。
3) 通過倒置或渦旋攪拌將樣品與磁珠混合。室溫下孵育至少10分鐘，以確保蛋白G與免疫球蛋白之間的有效結(jié)合。結(jié)合效率與時間和配體有關(guān)，孵育時間可延長至1小時，以提高抗體產(chǎn)量。
4) 將試管放在磁分離器上，磁分離澄清。
5) 用移液管吸出偶聯(lián)上清液。上清液可丟棄或分析以確定 Ig 容量。
6) 用至少3×500 μl結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠，去除磁珠上未結(jié)合Ig和/或不需要的樣品蛋白質(zhì)。
7) 每次洗滌后，磁分離，用移液管吸出上清液。
8) 各洗滌步驟的上清液可與偶聯(lián)上清液混合進行定量或凝膠電泳（如需要）。
9) 現(xiàn)在可以按 2.3 中所述從微粒中洗脫捕獲的 Ig，或用于免疫沉淀（3.1；從步驟 7 開始）。
10) 可選： 此時可將結(jié)合的抗原或抗體進行脫鹽或緩沖液替換，方法是用適合下游應(yīng)用的緩沖液/水進行洗滌。
2.3. 回收/洗脫捕獲的免疫球蛋白
捕獲的免疫球蛋白可通過加入低 pH 值的洗脫緩沖液（如 pH 值為 2.5 的 0.1 M 甘氨酸或 2.5% 乙酸）從微顆粒中洗脫出來。
1) 向包被捕獲 Ig 的 磁珠中加入 50 μl 洗脫緩沖液，持續(xù)充分混合。洗脫體積可根據(jù)要求調(diào)整；但洗脫體積過低可能會對Ig產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。
2) 讓捕獲的 Ig 在室溫下從微粒中洗脫1-2分鐘。
3) 磁分離，移液管吸出含洗脫的溶液。該溶液可用于量化洗脫Ig的濃度，或用凝膠電泳分析。
4) 可重復(fù)步驟1-3，以提高洗脫的回收率。
5) 匯總洗脫液，加入 5-7 μl 的5 M NaOH 或 1 M Tris pH 9.0 中和洗脫液的 pH 值。
6) 純化的Ig可用于定量或下游分析。
3. 免疫沉淀流程
MagStart-Protein G磁珠還可用于直接或間接免疫沉淀（IP）反應(yīng)的抗體捕獲。對于直接 IP，用戶指定的抗體（Ab）首先通過蛋白 A-抗體介導(dǎo)的結(jié)合與磁珠相連。這些免疫親和磁珠隨后用于從血清或細胞裂解物等粗樣品中特異性捕獲感興趣的抗原（如生物大分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物）。IP 的另一種方法是先將用戶指定的抗體與含抗原的樣品孵育，形成抗原-抗體復(fù)合物。然后將用Protein G磁珠進行捕獲。間接 IP 可能還包括通過使用第二抗體（通過親和捕獲固定在 MagStart-Protein G磁珠上的抗抗體）從樣品中捕獲抗原抗體復(fù)合物。
3.1. 免疫沉淀 (IP) 程序
由于 IP 有多種變化，以下方案僅指導(dǎo)原則作示例。具體的 IP 參數(shù)可能會發(fā)生變化，因此需進行優(yōu)化，這些參數(shù)包括：抗體和配體的數(shù)量、樣品濃度、孵育時間、溫度和緩沖液成分、樣品濃度、孵育時間、溫度和緩沖液成分。 以下方案可根據(jù)需要進行調(diào)整，用于直接或間接 IP洗脫。
1) 按照 2.1.步驟 1-6 準(zhǔn)備蛋白 A 磁珠并平衡。
2) 去除最后的結(jié)合/洗滌緩沖液后，用 100 μl 結(jié)合/洗滌緩沖液重懸MagStart-Protein G磁珠。
3) 在磁珠懸浮液中加入捕獲抗體（每 50 μl 最多 120 μg）。
4) 室溫孵育10-30分鐘使捕獲抗體固定在磁珠上。
5) 磁分離，吸出抗體溶液（棄掉或用于定量）。
6) 用 300 μl 結(jié)合緩沖液（如 TBS 或 PBS）洗滌磁珠三次。
7) 最后一次洗滌后，將離心管從磁力架上取下，加入含目標(biāo)抗原樣品（最終體積至少為 500 μl，用于末端混合）。
8) 輕輕倒置混合均勻，在 2-8°C下持續(xù)混合孵育?？贵w與抗原相互作用的最佳時間可能會有所不同（請參考抗體制造商推薦的孵育時間；通常范圍為 1 小時至過夜）。
9) 磁分離吸出樣品溶液，丟棄或用于下游分析。
10) 用 300 μl 結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠三次。洗滌液可與步驟 9 中的樣品溶液合并進行分析。
11) 可選： 此時可將結(jié)合的抗原或抗體進行脫鹽或緩沖液交換，方法是用適合下游應(yīng)用（如質(zhì)譜分析）的緩沖液/水進行洗滌。
12) 抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物可根據(jù) 2.3 從微粒中洗脫出來。
4. 抗體結(jié)合指引
5. 試劑適應(yīng)性
MagStart-Protein G 磁珠相容組成如下:
Reagent
Concentration
Tween? 20
≤1%
Tris, Sodium phosphate, Triethanolamine
≤100 mM
NaCl
≤1 M
6. 常見問題
問題
可能原因
改善方法
抗體未如預(yù)期那樣與微粒結(jié)合
反應(yīng)時間不足
將反應(yīng)時間擴充到1小時
不正確的結(jié)合pH
檢查和調(diào)整結(jié)合液pH7.4-8.0
樣品或溶液中的干擾物阻止結(jié)合
將樣品脫鹽或透析到推薦的結(jié)合液中，以去除培養(yǎng)基成分/其他污染物
微粒數(shù)不足
增加顆粒的數(shù)量
生物分子含量過低
通過樣品濃度增加抗體含量或制備更多起始材料
抗體與蛋白G不相容
蛋白G并非多所有抗體特異
生物分子的非特異吸附
離子或靜電作用導(dǎo)致的非特異吸附
增加結(jié)合、洗滌、洗脫緩沖液中的NaCl濃度；增加結(jié)合洗滌液中吐溫20濃度
洗滌不充分
增加洗滌次數(shù)、洗滌液體積和平衡時間
低的看題洗脫回收率
洗脫條件太溫和
增加洗脫時間，替換洗脫緩沖液，務(wù)必保證洗脫緩沖液pH<3.0
洗脫后蛋白失活
蛋白在洗脫液中可能不穩(wěn)定或失活
替換洗脫緩沖液，或立即使用5 M NaOH 或 1 M Tris pH 9.0中和洗脫液
參考文獻：
1. Maimela P W M, Smith M, Nel A J M, et al. Humoral immunoprofiling identifies novel biomarkers and an immune suppressive autoantibody phenotype at the site of disease in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Frontiers in Oncology, 2024, 14: 1330419.
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