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一、概述
PuriMag Homo-NH2均勻的、但分散的表面具-NH 2官能團(tuán)的超順磁微粒，由Fe3O4核和GMA涂層組成。通過GMA修飾，-NH2基團(tuán)通過短的親水性連接臂連接到磁珠上。親水表面確保磁珠在各種緩沖液中具有出色的分散性和易操作性。表面具有反應(yīng)性胺基的磁珠允許配體如蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物或其它特異性分子的固定。配體的固定可通過醛或酮的還原胺化而不預(yù)先活化磁珠表面。或者，EDC交聯(lián)劑可用于羧基將配體與胺偶聯(lián)。最后，胺反應(yīng)性雙功能交聯(lián)劑用于引入其它官能團(tuán)以偶聯(lián)配體。
PuriMag Homo-NH2可以用肽、酶、碳水化合物等包被以分離不同的靶標(biāo)，如激素、受體、凝集素、疾病標(biāo)志物、噬菌體。一旦與配體結(jié)合后，將磁珠加到含目標(biāo)分子的樣品中，短時間孵育后，可通過磁珠親和捕獲靶標(biāo)。磁分離可除去不需要的上清液，洗滌目標(biāo)結(jié)合的磁珠以得到純樣品。磁珠結(jié)合的靶標(biāo)可直接用于生物測定，并在SDS-PAGE上分析。用常規(guī)洗脫方法可將目標(biāo)分子從磁珠上洗脫下來。
二、產(chǎn)品特性
1. PuriMag HomoS-NH2
基團(tuán)密度> 600 umoles amine/g beads
2. PuriMag HomoL- NH2
基團(tuán)密度> 300 μmoles amine/g beads
形態(tài)：超順磁球形
直徑：1μm
儲存：10 mg/mL ，去離子水中 2~8 °C保存，勿凍結(jié)。
常溫運(yùn)輸，正確使用保存期一年。
方案1. 用于連接醛和酮
含有醛和酮的配體可通過形成Schiff's堿與氨基磁珠偶聯(lián)，并用氰基硼氫化鈉還原胺化。醛基可通過高碘酸鈉氧化糖蛋白中的糖殘基或多糖中相鄰羥基的C-C鍵的裂解而容易地制備。
緩沖液
? 偶聯(lián)緩沖液 Coupling Buffer (0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl or 100mM sodium borate, pH9.5 or 100mM sodium citrate, pH9.5);
5M Sodium Cyanoborohydride in 1M NaOH;
0.1M Ethanolamine, pH7.4;
清洗氨基磁珠
1. 徹底重懸氨基磁珠并轉(zhuǎn)移足量磁珠到干凈EP管中。磁分離，并吸棄上清液。從磁力架上取下EP管，加入200μl偶聯(lián)緩沖液重懸磁珠。磁分離，并吸棄上清液。
2. 用上述緩沖液清洗兩次。
配體的結(jié)合
1. 將配體溶解偶聯(lián)緩沖液中至濃度1-10 mg/ml。
2. 將適量的配體加入洗過的氨基磁珠并混勻。
3. 每100μl反應(yīng)混合物中加入1μl的5M氰基硼氫化鈉（溶于1M NaOH溶液），室溫下孵育2小時。磁分離，并吸棄上清液。
4. 加入反應(yīng)混合物同體積的0.1M乙醇胺，并在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育15分鐘。磁分離，吸棄上清液。
5. 加入適量的PBS并混勻磁珠。磁分離，吸棄上清液。
6. 重復(fù)步驟5兩次。
方案2. 用NHS交聯(lián)劑活化
最常見的一類活化劑是NH。根據(jù)交聯(lián)劑的性質(zhì)，可與待固定的配體中的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)，包括胺、巰基、羧基和羥基以及非選擇性光反應(yīng)。NHS交聯(lián)劑通常必須在使用前新配。與待固定的配體量相比，使用10倍摩爾過量。
偶聯(lián)緩沖液Coupling Buffer (0.1 M sodium phosphate buffer with 0.15 M NaCl, pH 7.4);
0.05 M Tris, pH 7;
氨基磁珠的活化
1. 用偶聯(lián)緩沖液重懸氨基磁珠。
注意：避免含有氨基的緩沖液如Tris或甘氨酸，因為它們會與NHS反應(yīng)競爭。
2. 根據(jù)說明溶解NHS，并將所需體積加入磁珠，混勻。可將水溶性NHS直接加入磁珠中。終體積應(yīng)等于瓶中最初的液體體積。
3. 室溫孵育30min。磁分離，吸棄上清。用上述緩沖液洗兩次。
4. 磁珠活化完成。
方案2-1. 用-NH2反應(yīng)性的NHS-酯交聯(lián)劑活化后偶聯(lián)
使用同雙功能交聯(lián)劑時，第二個NHS-酯基團(tuán)將與配體中的-NH2反應(yīng)，因此通常用于固定肽或蛋白質(zhì)的N-末端。步驟如下：
1. 重新懸浮活化的氨基磁珠。使用相同的緩沖液將體積調(diào)整到所需的磁珠濃度。
2. 加入計算后一定量的配體，混勻。
3. 室溫下孵育30分鐘或4°C下緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)2小時。
4. 孵育后，將試管置于磁鐵上2分鐘，取出上清液。
5. 加入0.05M 的Tris（pH7）并在室溫下溫育15分鐘以猝滅未反應(yīng)的活性氨基。
6.用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠兩次。
方案2-2. 用-SH反應(yīng)性的NHS-酯交聯(lián)劑活化后偶聯(lián)
巰基活性基團(tuán)通常是吡啶二硫基或碘代/溴代乙酰基。寡核苷酸也可使用馬來酰亞胺。適當(dāng)?shù)木彌_液和孵育條件與巰基反應(yīng)，配體須含待固定的游離巰基。
1. 重新懸浮活化的磁珠。根據(jù)所選的巰基反應(yīng)基團(tuán)使用緩沖液（請參見下表）。使用相同的緩沖液將體積調(diào)整到所需的磁珠/配體濃度。
2. 加入計算量的游離巰基配體，渦旋混勻。
3. 按下表推薦的時間和溫度孵育。
4. 孵育后，可加入半胱氨酸至終濃度為5mM以淬滅未反應(yīng)基團(tuán)。室溫下孵育15分鐘。
5. 如所述洗滌偶聯(lián)的磁珠。
SH-reactive group
Recommended buffer
Recommended condition
Maleimide
0.1M sodium phosphate pH 6.5-7.5
4 h at 4℃ or 2 h at room temperature
Iodo/Bromoacetyl
0.05M sodium borate pH8.3
1h, room temperature. Protect from light.
Pyridyldithio
Phosphate buffered saline (PBS) pH7.5
Over night at room temperature
方案2-3. 用光反應(yīng)性的NHS-酯交聯(lián)劑活化后偶聯(lián)
光反應(yīng)基團(tuán)如羥苯基疊氮化物、硝基苯疊氮化物、苯疊氮化物或全氟芳基疊氮化物等可與胺基反應(yīng)。帶有光反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑的活化必須在暗室條件下進(jìn)行。
1. 重新懸浮活化的氨基磁珠。根據(jù)活性基團(tuán)選擇緩沖液。用相同緩沖液將體積調(diào)整到所需的磁珠/配體濃度。
3. 使用推薦的時間、溫度、適當(dāng)波長的光照射。
注意：磁珠可能會熄滅光，因此須優(yōu)化。
3. 將偶聯(lián)的磁洗兩次。
注意：磁珠與DMF等有機(jī)溶劑相容，上述活化和偶聯(lián)均可在干燥有機(jī)溶劑中進(jìn)行。這將消除競爭性水解反應(yīng)，因此通過延長反應(yīng)時間可獲得更高產(chǎn)率。將磁珠從有機(jī)溶劑移至緩沖液之前，用純水洗滌一次。
方案3. 用具有胺和羧基反應(yīng)性的交聯(lián)劑活化，以偶聯(lián)含羧基的配體
在配體中不存在其他伯氨基的條件下，可通過使用EDC或EDC / NHS（或其它碳二亞胺）將磁珠表面的胺基和配體中的羧基連接在一起。 EDC與羧基反應(yīng)形成胺反應(yīng)性中間體，該中間體在水溶液中不穩(wěn)定。為了穩(wěn)定，可引入NHS。
偶聯(lián)緩沖液Coupling Buffer (0.1 M MES, 0.5 M NaCl, pH 6.0);
注意：對于使用EDC的偶聯(lián)反應(yīng)，避免使用含游離胺或磷酸鹽的緩沖液，因為這會干擾偶聯(lián)效率。Tris，乙酸鹽和甘氨酸緩沖液都易與EDC或偶聯(lián)中間體反應(yīng)。還應(yīng)避免含硫醇緩沖液，因為它們不可逆地結(jié)合EDC并抑制偶聯(lián)。
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC);
Sulfo-NHS or N-hydroxysuccinimide (NHS);
封閉緩沖液Quenching Buffer (50mM Tris, pH 8.0 or 5-10mM Hydroxylamine);
PBS;
偶聯(lián)羧基配體
1. 偶聯(lián)緩沖液0.1 M MES (2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid), pH 4.5–5 (or 0.1 M MES, 0.5 M NaCl pH 6.0) 洗滌磁珠。將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
2. 將配體溶解在上述偶聯(lián)緩沖液中至1–10 mg / mL的濃度，并加入推薦量的配體至上述磁珠，移液器吹打混勻。
3. 將10 mg EDC溶于1 mL冷去離子水中（或每mL溶解10 mg EDC和15 mg NHS）。
4. 注：EDC溶液和NHS溶液應(yīng)新配，避光保存在冰上。
5. 每毫克配體，添加50–100μL的EDC（或EDC / NHS）溶液并渦旋。
6. 在室溫下孵育2h，或在4°C下緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)孵育2h。
封閉磁珠
1. 加入500μl封閉緩沖液并重懸磁珠。室溫孵育30分鐘。
2. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
3. 加入500μl封閉緩沖液重懸磁珠。磁分離，吸棄上清。
4. 加入500μL的PBS（pH7.4）重懸磁珠。將EP管置于磁力架60秒，并吸棄上清液。重復(fù)洗滌2次。
5. 加入100μL的 PBS（pH7.4），重懸磁珠，4°C儲存。
附錄1：
A．免疫共沉淀分析
1. 將至少100μl含有靶抗原的細(xì)胞裂解物樣品加入到來自步驟6的磁珠管中并渦旋10秒。
2. 室溫孵育30分鐘或4°C過夜，輕輕搖動。磁分離，棄上清。從磁力架上取下試管，加入200μl洗滌液重懸磁珠。磁分離，棄上清液，從磁力架上取下EP管。再洗兩次去除未結(jié)合抗原。
3. 采用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液并在95°C加熱磁珠5分鐘。將磁珠/上樣緩沖液混合物直接加到SDS-PAGE凝膠上，并按正常進(jìn)行電泳和印跡。
B．抗體和抗原的排除：向磁珠、抗體、抗原混合物中加20μl洗脫液重懸磁珠。室溫下孵育2min。磁分離，收集上清液到新EP管，加入2μl中和緩沖液（如1M Tris-HCl，pH8.5）調(diào)pH。
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