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規(guī)格
MS-NTA001
1 ml
MS-NTA010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-NTA是一種專有的磁性聚合物微粒載體，用于Ni親和捕獲、純化和回收His標(biāo)簽融合蛋白。MagStart微球技術(shù)的進步使生物分子可在整個微?？臻g滲透和結(jié)合，提供了極高的高官能團密度允許His標(biāo)簽的生物分子的多點親和捕獲，從而增強靶蛋白的結(jié)合。這一特性使得在結(jié)合緩沖液中能夠使用較高的咪唑濃度，從而減少雜蛋白的非特異結(jié)合，進而提高目標(biāo)蛋白的純度。MagStart-NTA可替代MagReSyn?NTA，非常適合從復(fù)雜的生物混合物（如細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清液）中以高效純化6×His標(biāo)記蛋白。MagStart-NTA在蛋白分離前不需樣品澄清（在細(xì)胞破壞后），改進了磁珠工作站自動純化的應(yīng)用。
先進的MagStart聚合物技術(shù)允許微粒進行對高度特異性的工程設(shè)計，以解決當(dāng)前微粒技術(shù)的局限性。MagStart可快速磁分離（<10 秒），可防止微粒的意外丟棄而避免潛在的代價高昂的樣品損失，提高了效率和回收率。這些微粒采用多種化學(xué)表面修飾，以提供超高純度的目標(biāo)蛋白，滿足嚴(yán)格的研發(fā)和質(zhì)譜樣品要求。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC) of Histidine (His)-tagged proteins
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Nitrilotriacetic acid (NTA) with chelated nickel (Ni2+)
Binding capacity
≥ 1.0 mg of a His-tagged GFP/ml suspension
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
25 mg/ml in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label. DO NOT FREEZE!
注意：不當(dāng)儲存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. 結(jié)合和洗脫程序
可能影響6×His蛋白的Ni親和純化效率的幾個因素為緩沖液組成和pH、污染物/干擾化合物的存在、可降解靶蛋白的蛋白酶存在及蛋白上6×His標(biāo)簽的位置（例如N-末端、C-末端或三明治融合標(biāo)簽）。MagStart-NTA在結(jié)合/洗滌和洗脫緩沖液中與8M尿素兼容。如沒達到最佳性能，請參閱本指南推薦的結(jié)合/洗滌/洗脫程序及故障排除指南。
注意：所有試劑都應(yīng)新制，并為分析級，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法和緩沖液只是一個例子，并不旨在進行限制。MagStart-NTA與一系列不同的緩沖液兼容，用于結(jié)合/吸附和洗脫/解吸?？蓪崿F(xiàn)的純度和產(chǎn)率是配體依賴性的，并且對于每種純化的配體都應(yīng)優(yōu)化實驗條件。
2.1. MagStart-NTA的平衡
MagStart-NTA以25 mg/ml的20%乙醇懸浮液的形式提供。使用前，需去除運輸溶液，并在結(jié)合緩沖液（如80 mM磷酸鈉，pH 7.4–8.0，40 mM咪唑，1.0 M NaCl）中平衡微粒。推薦的方案可以放大或縮小以滿足您的要求-目前的方案估計可結(jié)合約20μg組氨酸標(biāo)記蛋白。
1） 充分混合徹底懸浮MagStart-NTA磁珠。
2） 將20μl（足以結(jié)合~20μg組氨酸標(biāo)記蛋白）MagStart-NTA轉(zhuǎn)移到新離心管中。
3）磁分離，用移液管吸棄上清。
4） 在200μl結(jié)合緩沖液中洗滌/平衡微粒30 s。
5） 將離心管放在磁分離器上，將磁鐵和離心管倒置兩次，以收集蓋子中殘留的任何微粒。
6） 用移液槍吸除結(jié)合緩沖液，重復(fù)步驟4和5兩次，總共洗滌三次。
7） 從步驟5吸去結(jié)合緩沖液后，MagStart-NTA磁珠準(zhǔn)備好結(jié)合6×His標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
2.2. 蛋白質(zhì)結(jié)合程序
作為標(biāo)準(zhǔn)措施，建議在蛋白質(zhì)純化前，通過0.2μm過濾器過濾或以10000 × g離心5分鐘來澄清含蛋白質(zhì)的樣品。
1） 將含His標(biāo)記蛋白的樣品添加到2.1準(zhǔn)備好的MagStart-NTA磁珠中。用至少1體積的結(jié)合緩沖液稀釋來調(diào)節(jié)結(jié)合體積（參見2.1），并充分混勻。
2） 使蛋白質(zhì)樣品在室溫下與磁珠結(jié)合5分鐘，同時進行溫和的間歇混勻。
3） 將離心管放在磁性分離器上，磁分離。
4） 用移液管吸去清液或者隨后用于蛋白質(zhì)定量或電泳（例如確定未結(jié)合的蛋白質(zhì)）。
5） 通過在200μl結(jié)合緩沖液中重懸洗滌結(jié)合蛋白，洗滌30 s，間歇渦旋。
6）磁分離，如管蓋中有磁珠，將磁性分離器倒置，使液體沖洗以收集磁珠。吸棄洗滌緩沖液。
7） 重復(fù)步驟5–6兩次，總共洗三次。洗滌步驟的上清液可丟棄或合并用于蛋白質(zhì)定量或電泳。
2.3. 蛋白質(zhì)洗脫程序
1） 將20–50μl洗脫緩沖液（80 mM磷酸鈉，pH 7.4–8.0，500 mM NaCl，500 mM-咪唑）加入2.2的磁珠中。通過移液或渦流充分混合。
2） 使蛋白質(zhì)在室溫下洗脫2分鐘。
3） 將離心管放在磁分離器上，磁分離。用移液管抽吸含有感興趣蛋白質(zhì)的洗脫液至一新離心管。
4） 為了提高其標(biāo)記蛋白的回收率，用額外的20-50μl洗脫緩沖液（總共三種洗脫液）再重復(fù)步驟1-3兩次。合并/匯集三種洗脫液。該蛋白質(zhì)現(xiàn)在已準(zhǔn)備好進行進一步的實驗或分析。
2.4. 咪唑和NaCl對蛋白質(zhì)結(jié)合和洗脫的影響
有效純化所需最佳咪唑濃度將取決于靶蛋白和組氨酸標(biāo)簽的位置（例如N-末端、C-末端或融合物）。較低的咪唑濃度可用于促進回收率/產(chǎn)率，盡管可能以犧牲純度為代價。MagStart磁珠的配方可在高達80mM咪唑的存在下結(jié)合6×His標(biāo)記的蛋白質(zhì)，而不會顯著影響目標(biāo)蛋白的回收或產(chǎn)量（蛋白質(zhì)和標(biāo)簽依賴性）。雖然在結(jié)合/洗滌步驟中增加咪唑濃度可用于提高靶蛋白的純度，但這可能導(dǎo)致產(chǎn)率的降低。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)，500mM咪唑通常足以洗脫，而其他蛋白質(zhì)可能需要高達1M咪唑才能有效洗脫。在進行高咪唑洗脫前，一定要檢查蛋白質(zhì)功能與這些條件的兼容性。NaCl的濃度可增加到2M以減少非特異性離子相互作用，從而潛在地增加標(biāo)記蛋白的純度。建議在磁珠中加入過量的His標(biāo)記蛋白，因為這可能有助于最大限度地減少非特異性相互作用，最大限度提高目標(biāo)蛋白純度。
3. 兼容性
目前方案已成功用于從含有以下任一成分的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 或 Tris 50mM pH 8.0 中提取的哺乳動物細(xì)胞裂解物中純化蛋白質(zhì)：
? Urea≤8 M ? Triton? X-100≤5%
? Tween? 20≤1% ? NaCl ≤2 M ? Glycerol≤50%
Tris, MOPS, Sodium/Potassium phosphate≤100 mM
4. 常見問題
問題
可能原因
改善方法
蛋白質(zhì)不會像預(yù)期的那樣與微粒結(jié)合
不正確的結(jié)合pH
將結(jié)合緩沖液的pH至少提高到7.4
感興趣的蛋白質(zhì)降解
向粗蛋白質(zhì)提取物中添加蛋白酶抑制劑
樣品中干擾化合物阻止結(jié)合
將樣品脫鹽或透析到推薦結(jié)合緩沖液，以去除介質(zhì)成分或干擾污染物
顆粒數(shù)量不足
增加磁珠的數(shù)量
蛋白含量過低
增加蛋白濃度或起始樣品量來增加蛋白含量
蛋白序列不對
通過測序確認(rèn)克隆
洗脫過程中蛋白質(zhì)回收率低
親和結(jié)合很強
提高洗脫液咪唑濃度
蛋白可能有金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域
增加咪唑濃度或用酸性液洗脫，如pH為3–4
蛋白質(zhì)在純化過程中發(fā)生降解
向樣品和緩沖液中添加蛋白酶抑制劑，以防蛋白水解。使用新制樣品和溶液，盡可能減少樣品制備時間，在4?C
蛋白在洗脫液中可能不穩(wěn)定或無活性
確定感興趣蛋白最佳pH和鹽穩(wěn)定性，并相應(yīng)地調(diào)整方案
洗脫蛋白純度不足（共洗脫污染蛋白）
洗滌效率低
增加洗滌次數(shù)和體積及洗滌液NaCl濃度（最高2M）。將洗滌液中咪唑濃度提高至80mM
靶蛋白的特異性降解
緩沖液中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解
靶蛋白不完全
使用的微粒數(shù)量不足
增加用于純化的MagStart-NTA的數(shù)量
洗脫后靶蛋白無活性
咪唑或緩沖鹽的干擾
通過透析、過濾、沉淀或排阻色譜去除咪唑或緩沖鹽。降低咪唑濃度以進行洗脫或在酸性緩沖液中洗脫，例如pH為3-4的檸檬酸鹽；用合適堿性緩沖液洗脫后立即降低pH。
不兼容下游應(yīng)用
咪唑、緩沖劑或鹽的干擾
通過透析、過濾、沉淀或排阻色譜去除咪唑。
參考文獻：
1. Acosta J, Nguyen K, Spitale R C, et al. Taylor-made production of pyrimidine nucleoside-5′-monophosphate analogues by highly stabilized mutant uracil phosphoribosyltransferase from Toxoplasma gondii[J]. Bioresource Technology, 2021, 339: 125649.
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