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MS-HLC001
1 ml
MS-HLC010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-HILIC（親水作用色譜）是一種專(zhuān)有磁性聚合物微球，用于固相萃取 （SPE） 和從可能干擾下游分析程序的含污染物樣品中回收生物分子，用于質(zhì)譜分析的樣品制備。MagStart-HILIC微球具混合模式功能，可對(duì)生物分子產(chǎn)生高親和力，隨后以小體積洗脫，從而在樣品處理過(guò)程中實(shí)現(xiàn)濃縮。MagStart-HILIC是復(fù)雜生物混合物（如培養(yǎng)上清液、組織提取物、血清或血漿）樣品制備的理想選擇，通過(guò)電泳、HPLC和質(zhì)譜分析樣品之前，從常規(guī)污染物（如SDS、CHAPS、NP-40和尿素）中制備樣品。磁輔助進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了常規(guī)質(zhì)譜凈化工作流程的自動(dòng)化，提高了重現(xiàn)性和數(shù)據(jù)質(zhì)量。可替代MagReSyn?-HILIC的使用。
先進(jìn)的MagStart聚合物技術(shù)允許微粒進(jìn)行對(duì)高度特異性的工程設(shè)計(jì)，以解決當(dāng)前基于微粒的技術(shù)的局限性。MagStart可快速磁分離（<10 秒），可防止微粒的意外丟棄而避免潛在的代價(jià)高昂的樣品損失，提高了效率和回收率。這些微粒采用多種化學(xué)表面修飾，以提供超高純度的目標(biāo)蛋白，滿足嚴(yán)格的研發(fā)和質(zhì)譜樣品要求。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Protein purification, proteomics, mass spectrometry sample preparation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
HILIC, Mixed Mode
Binding capacity
≥20 mg/ml (BSA)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label. DO NOT FREEZE!
注意：不當(dāng)儲(chǔ)存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. 結(jié)合和洗脫程序
HILIC（親水作用液相色譜法）是通過(guò)施加有機(jī)流動(dòng)相，將兩親性生物分子捕獲在固定相表面形成的富水層之間的過(guò)程。這種機(jī)制用于將生物分子與極性較低化合物分離。氫和弱靜電相互作用與生物分子在水層的保留有關(guān)，而離子添加劑（如醋酸銨和甲酸銨）常用于控制樣品pH值和離子強(qiáng)度。
注意：目前方案適用于MS分析中胰蛋白酶消化之前凈化還原和烷基化蛋白質(zhì)，并且尚未評(píng)估肽的凈化。有關(guān)適合MS的工作流程示例，請(qǐng)參閱文獻(xiàn)。
注意：所有試劑應(yīng)新鮮制備，并具有分析級(jí)，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法、緩沖溶液和配體僅供參考，并非旨在限制。純度和產(chǎn)量取決于實(shí)驗(yàn)條件，應(yīng)針對(duì)每種應(yīng)用單獨(dú)優(yōu)化。
2.1. MagStart-HILIC的平衡
MagStart-HILIC以 20 mg/ml懸浮于20% 乙醇液的形式提供。使用前需要去除運(yùn)輸溶液，并在結(jié)合緩沖液中平衡微粒?？筛鶕?jù)推薦的方案按比例放大或縮小以滿足您的要求，但每個(gè)反應(yīng)至少需要10μl微粒懸浮液的體積，以確保合適的磁性微粒沉淀用于緩沖液的抽吸。當(dāng)前方案經(jīng)優(yōu)化，可在25μl樣品體積內(nèi)將50μg總蛋白與500μg磁珠（蛋白質(zhì)與磁珠比例1：10）結(jié)合（該協(xié)議的最小值）。該程序已被證明在低至20 μg的總蛋白濃度下有效。
1）通過(guò)渦旋混合3秒徹底重懸MagStart-HILIC，以確保懸浮液均勻。
2）將 25 μl （500 μg）磁珠轉(zhuǎn)移到新的 2 ml離心管中（建議低蛋白結(jié)合以提高樣品回收率）。
3）磁分離，待上清液澄清。
4）用移液槍吸取出上清液并丟棄。
5）在250μl平衡緩沖液中洗滌平衡微粒，混勻1分鐘。磁分離，吸棄上清。重復(fù)該步驟1次。
6）去除結(jié)合緩沖液后，磁珠即可用于結(jié)合蛋白。
2.2. 蛋白質(zhì)結(jié)合程序
蛋白應(yīng)提取并溶解在含合適去污劑或離液劑的低摩爾濃度緩沖液（如 50 mM Tris pH 8.0）中，以增加蛋白樣品的溶解度。該方案已被證明可有效從50mM Tris pH 8.0或PBS的細(xì)胞裂解物中去除高達(dá)5%的SDS，2%CHAPS，1%NP40或8M尿素；制備這些相容的蛋白質(zhì)溶解劑。如在質(zhì)譜分析前需酶消化，則應(yīng)在磁珠純化前對(duì)樣品還原和烷基化。
1）用蛋白質(zhì)溶解緩沖液將樣品調(diào)節(jié)至最小25μl，并加入等體積（1：1）結(jié)合緩沖液，最終體積為50μl（最?。?。
注意：結(jié)合程序適用于體積增加的樣品（例如，在蛋白質(zhì)濃度較低的情況下）。
2）將樣品加入平衡的磁珠中，移液器吹打混合。
3）讓蛋白質(zhì)與微粒結(jié)合30分鐘。輕柔而連續(xù)地混合，以確保在結(jié)合過(guò)程中樣品微粒相互作用良好。
4）磁分離，吸除上清液（注意：可以分析上清液以確定是否存在未結(jié)合的蛋白質(zhì)）。
5）將珠子重懸于200μl洗滌緩沖液并充分混合。磁分離，吸除上清液。重復(fù)該洗滌步驟1次。
6）繼續(xù)執(zhí)行2.3進(jìn)行蛋白質(zhì)消化，或繼續(xù)進(jìn)行替代程序2.4進(jìn)行蛋白質(zhì)洗脫。
2.3. 蛋白質(zhì)消化程序
將含有結(jié)合蛋白質(zhì)的MagStart-HILIC 微粒直接施加到胰蛋白酶溶液中，可用胰蛋白酶等酶消化蛋白質(zhì)。所得肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，無(wú)需進(jìn)一步純化。注意：為確保有效消化，在HILIC純化之前，應(yīng)還原和烷基化蛋白質(zhì)（根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案）。
1）將微粒與2.2吸附的蛋白質(zhì)混合物重懸于50-200μl合適的消化緩沖液中，例如含有消化酶的5-10mM碳酸氫銨。對(duì)于測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，我們建議酶與蛋白質(zhì)的比例為1：10。
2）根據(jù)酶規(guī)格在合適溫度和時(shí)間段內(nèi)孵育樣品。對(duì)于測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，建議37°C下孵育 4 小時(shí)。
3）磁分離，用移液管吸出含有肽的上清液。
4）根據(jù)需要進(jìn)行真空干燥或凍干以濃縮肽樣品。
5）MS分析時(shí)重懸肽，例如2%乙腈和0.2%甲酸。
6）進(jìn)行質(zhì)譜分析。
2.4. 蛋白質(zhì)洗脫程序（替代上述 2.3）
1）將微粒與吸附的蛋白質(zhì)混合物（來(lái)自2.2）重懸于50μl洗脫溶液中，并在室溫下解吸5分鐘。連續(xù)混合以確保微粒在洗脫過(guò)程中保持懸浮狀態(tài)。
2）磁分離，并用移液槍吸出上清液（含蛋白質(zhì)）。
3）可重復(fù)步驟1-2，提高蛋白質(zhì)回收率。
4）混合洗脫液，必要時(shí)凍干或真空過(guò)濾濃縮。
注意：對(duì)于蛋白質(zhì)含量低的樣品，在分析之前可能需要樣品的濃縮（例如真空干燥或凍干）。
3. 推薦緩沖液
平衡緩沖液：100 mM乙酸銨，pH 4.5，15%乙腈
結(jié)合緩沖液：200 mM乙酸銨，pH 4.5，30%乙腈
洗滌緩沖液：95%乙腈（5%水）
洗脫液：100%乙醇 ；酸溶液：10%甲酸
4. 兼容性
目前方案已成功用于從含有以下任一成分的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 或 Tris 50mM pH 8.0 中提取的哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物中純化蛋白質(zhì)：
? 8 M Urea ? 4% SDS
? 2% CHAPS ? 1% NP40
目前方案不適用于從含有以下組分的哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物中純化蛋白質(zhì)：
? 6 M 鹽酸胍溶于 50 mM Tris，pH 8.0
5. 常見(jiàn)問(wèn)題
問(wèn)題
可能原因
改善方法
低蛋白結(jié)合
乙腈濃度低
確保結(jié)合前樣品最終乙腈濃度為15%，評(píng)估乙腈濃度增加至80%。監(jiān)測(cè)乙腈濃度增加時(shí)潛在的蛋白質(zhì)沉淀。
含鹽量高
降低鹽濃度以增加吸附。鹽濃度不應(yīng)超過(guò) 100 mM。
樣品中不相容的試劑
調(diào)整樣品制備，僅包括兼容的離液劑和HILIC緩沖液。在使用磁珠進(jìn)行凈化前稀釋離液劑或增溶劑。
混合不足
使用 2 ml Protein LoBind 試管，確保易于混合并減少微粒對(duì)試管側(cè)壁的吸附。
酶解后的序列覆蓋率低或質(zhì)譜信號(hào)低
消化不完全。
確保最佳制備和消解條件：確保樣品被有效還原和烷基化；消化pH =8；合適蛋白/酶比例；37°C消解。如必要，增加消化時(shí)間。
肽回收率低或洗脫不完全
消化后清洗微粒以提高回收率。通過(guò)對(duì)結(jié)合和洗脫樣品進(jìn)行凝膠分析，確保蛋白質(zhì)與微粒結(jié)合。
蛋白質(zhì)濃度低
通過(guò)真空干燥或凍干在質(zhì)譜分析之前減少樣品量。
變性劑去除不完全
雜質(zhì)殘留
需要使用額外的乙腈清洗劑進(jìn)行更嚴(yán)格清洗程序。
交替操作過(guò)程中蛋白洗脫不完全
將結(jié)合緩沖液的摩爾濃度降低至 20 至 50 mM 之間，以減少珠子-蛋白相互作用。
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