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一、概述
Strep-Tag系統(tǒng)是模擬鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)的新型蛋白純化系統(tǒng)，Strep-Tactin 對Strep-Tag II的親和能力與鏈霉親和素相比，至少強(qiáng)10倍以上，且分離純化條件溫和，在生理?xiàng)l件下即可實(shí)現(xiàn)蛋白的分離純化；此外，與其他tag相比，Strep-Tag II為8個氨基酸的小標(biāo)簽（WSHPQFEK），由于標(biāo)簽小，僅為1 kDa左右，不影響融合后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。這些溫和的純化參數(shù)能保存蛋白質(zhì)的生物活性，并僅經(jīng)一步提取即可產(chǎn)出超過99%的純度。Magarose-Strep-Tactin磁珠采用特殊的蛋白偶聯(lián)工藝，將Strep-Tactin蛋白共價偶聯(lián)到超順磁性瓊脂糖磁珠表面，制備了一種專為高效、快速分離純化Strep-tag II蛋白的一種新型功能化材料，實(shí)現(xiàn)并搭建了提取速度、提取量及純度兼得的蛋白純化平臺。
二、產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱
Magarose- Strep-Tactin
貨號
PMAG003
磁珠濃度
25% (v/v) in 1×PBS (0.1% Tween-20+0.05% NaN3)
配基密度
~6 mg Strep-Tactin /ml磁珠
介質(zhì)
6%交聯(lián)磁性瓊脂糖
粒徑
20-45μm
配體結(jié)合
~7 mg Strep-tag II蛋白/ml磁珠
保存
2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白結(jié)合量與目標(biāo)蛋白特性相關(guān)，此處僅作參考值。
三、使用方法
1. 適用范圍
可用于從任何表達(dá)系統(tǒng)，包括桿狀病毒、哺乳動物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌中含有Strep-Tag II標(biāo)簽蛋白的分離純化。
2. 操作流程
目標(biāo)蛋白與磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率，各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度。以下提供一個較為廣泛應(yīng)用的Strep-Tag II蛋白的純化流程，用戶可參考該操作流程，或者根據(jù)自己蛋白的特性自行設(shè)計和優(yōu)化蛋白純化流程。
2.1 緩沖溶液配制
Binding/Washing Buffer ：10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0；
Elution Buffer：2.5 mM desthiobiotin in Binding Buffer；
Regeneration Buffer: 0.5 M NaOH or 1 mM HABA in Binding Buffer；
2.2 樣品處理
本《用戶手冊》提供以下三種樣品的處理方法：
(1) 大腸桿菌、酵母等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白：表達(dá)細(xì)胞用適量Binding Buffer稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF）；冰浴超聲裂解細(xì)胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過于粘稠，可根據(jù)需要在粗樣品中加入適量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，如果目標(biāo)蛋白含量較低，建議將粗蛋白樣品進(jìn)行離心操作。
(2) 胞外表達(dá)蛋白：取胞外表達(dá)上清，用等量Binding Buffer稀釋平衡，即為粗蛋白樣品。
(3) 動物細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)蛋白：取適量動物細(xì)胞，用適量PBS洗1次，棄上清；用適量含1%（v/v） Triton X-100或1%（v/v）NP-40的Binding Buffer重懸；加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF）；置于冰上10 min，即為粗蛋白樣品。
2.3 磁珠預(yù)處理
一般情況下，磁珠用量由用戶根據(jù)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量和磁珠載量計算獲得。如：采用大腸桿菌表達(dá)某目標(biāo)蛋白，250 mL發(fā)酵液收獲1 g濕重的菌體，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)估算其目標(biāo)蛋白產(chǎn)量為~7 mg，用戶需要取4 mL 25%的磁珠懸液用于目標(biāo)蛋白的純化。以下即以此為例進(jìn)行詳細(xì)說明：
(1) 將磁珠置于漩渦混勻器上充分混勻，用移液器取10 mL磁珠懸液于離心管中；
(2) 將離心管置于磁性分離器上，移去上清液；
(3) 加入5~10 mL Binding Buffer/Washing Buffer到上述裝有磁珠的離心管中，蓋緊蓋子，漩渦振蕩15 s，使磁珠重新懸浮。將離心管置于磁性分離器上，磁性分離，移去上清液，重復(fù)洗滌2次。
（注：磁分離過程中，為減少磁珠使用過程中損耗，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子，保持離心管仍在磁分離器上，手持磁分離器與離心管上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，用澄清溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠，靜置片刻，使溶液重新澄清；以下同。）
2.4 目標(biāo)蛋白與磁珠結(jié)合
(1) 用10 mL Binding Buffer重懸1 g濕重的菌體，進(jìn)行破碎和裂解后，即為粗蛋白樣品；
(2) 將粗蛋白樣品轉(zhuǎn)移到裝有已預(yù)處理磁珠的離心管中，蓋緊離心管蓋；
(3) 將離心管置于漩渦混勻器振蕩15 s，然后將其置于垂直混合儀上，室溫垂直混勻30 min（如果需要，可在2~8℃的低溫環(huán)境下旋轉(zhuǎn)混合約1 h，防止目標(biāo)蛋白降解）；
(4) 將離心管置于磁性分離器上進(jìn)行磁性分離，移出上清液到新的離心管中以備后續(xù)檢測。從磁性分離器上取下離心管進(jìn)行下一步洗滌步驟。
2.5 磁珠洗滌
(1) 將步驟4的磁珠中加入5~10 mL Washing Buffer，漩渦混合2 min，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測；
(2) 繼續(xù)將上述磁珠中加入5~10 mL Washing Buffer，漩渦混合2 min，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管，避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標(biāo)蛋白；磁性分離，移出上清液到收集管，以備取樣檢測；
2.6 目標(biāo)蛋白洗脫
(1) 加入2~5 mL Elution Buffer（用戶根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度）于離心管中，蓋緊離心管蓋，將離心管置于垂直混合儀上，室溫垂直混合洗脫10 min；磁分離，收集洗脫液到新離心管中，即為純化的目標(biāo)蛋白樣品；
(2) 如需要，可重復(fù)上述步驟1次，收集樣品到新離心管中，以檢測目標(biāo)蛋白是否洗脫完全。
2.7 磁珠再生和保存
(1) NaOH再生：洗脫目的蛋白后的磁珠按照以下順序進(jìn)行洗滌： 5~10 mL純化水洗滌3次、5~10 mL 0.5M NaOH 洗滌3次、5~10 mL純化水洗滌至中性，最后加入10 mL保存液，將磁珠放置2~8℃環(huán)境保存。
(2) HABA再生：用脫硫生物素洗脫目標(biāo)蛋白后的磁珠，還可用HABA緩沖液再生，加入5~10 mL 1mM HABA洗滌磁珠5次，接著用Binding Buffer洗磁珠至本身顏色，每次洗5 min，最后加入4 mL 保存液，將磁珠放置2~8°C保存。
3. 蛋白純化流程的優(yōu)化
以上操作流程適用于大部分Strep-Tag II標(biāo)簽蛋白的純化，根據(jù)目標(biāo)蛋白與磁珠的結(jié)合性能不同，用戶可從以下方面對純化流程優(yōu)化，以提高目標(biāo)蛋白回收率和純度。
3.1 提高目標(biāo)蛋白回收率的參考方法
(1) 延長蛋白溶液與磁珠孵育的時間；
(2) 添加合適蛋白酶抑制劑，防止目標(biāo)蛋白降解；
(3) 增加磁珠用量；
(4) 延長洗脫目標(biāo)蛋白的時間或增加洗脫次數(shù)；
3.2 提高目標(biāo)蛋白純度的參考方法
(1) 在純化過程中添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標(biāo)蛋白降解；
(2) 延長洗滌的時間，增加洗滌次數(shù)；
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