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貨號
產(chǎn)品名稱
包裝
PMG-TagAb002-1mL
PuriMag? Rabbit IgG Magnetic Beads （兔IgG磁珠）
1mL×1
PMG-TagAb002-5mL
1mL×5
保存條件： 4oC保存，兩年有效。長期不使用，可以-20oC保存，-20oC可以保存更長時間。
一．產(chǎn)品簡介
2 PuriMag? Rabbit IgG Magnetic Beads，即兔IgG磁珠，也稱兔IgG免疫磁珠、Rabbit Normal IgG Magnetic beads，是由高品質(zhì)的正常兔IgG與納米磁珠共價偶聯(lián)而成，通常用作免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）等抗體相關(guān)實驗時兔來源抗體磁珠的對照IgG磁珠。
2 本兔IgG磁珠中的兔IgG為正常的兔IgG（Normal Rabbit IgG），是一種未經(jīng)任何標(biāo)記的非特異性IgG。
2 本兔IgG磁珠作為對照磁珠時，可排除IgG本身和特定目的蛋白或其它特定生物分子的非特異性結(jié)合。
2 與國內(nèi)外大多數(shù)的同類產(chǎn)品相比，本產(chǎn)品不易產(chǎn)生非特異吸附。每毫升磁珠懸液含~10mg磁珠，結(jié)合~0.5mg兔IgG抗體，該磁珠基本不會識別任何抗原。參考正?？贵w免疫磁珠的用量。
二．主要技術(shù)指標(biāo)
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled antibody
Normal Rabbit monoclonal antibody
Isotype
Rabbit IgG
M.W. of antibody
Approximately 150kDa
Antibody concentration
≥0.5mg Rabbit IgG per ml beads
Binding capacity
None
Specificity
Elution method
Elution with acid, competing peptide or SDS‐PAGE loading buffer
Application
IP, Co-IP, Protein purification
三．注意事項
l 本產(chǎn)品經(jīng)測試，反復(fù)凍融3次以上，不影響使用效果。
l 本產(chǎn)品需維持pH為6-8，避免高速離心和干燥；請勿長時間置磁珠于磁場中，否則可能會引起磁珠聚團(tuán)。
l 本產(chǎn)品使用前要適當(dāng)充分重懸，混勻操作須輕柔，不宜劇烈渦旋震蕩等，避免抗體變性等。
l 在免疫沉淀或純化時，建議設(shè)置陽性和陰性對照組。
l 蛋白樣品收集后宜盡快完成純化工作，并應(yīng)始終放置在4oC或冰浴，以減緩蛋白降解或變性。為有效抑制蛋白降解，可以在蛋白樣品中添加適量的蛋白酶抑制劑混合物。
l 如果使用真空泵等儀器吸取上清液，須注意真空泵的吸液強度，以免吸力過大而吸取到聚集的磁珠。
l 酸性溶液洗脫時磁珠可能會發(fā)生聚集，屬于正?，F(xiàn)象，不影響磁珠的正常使用。0.1%的非離子型去垢劑（如Triton X-100、Tween-20或NP-40）可有效防止磁珠聚集，并且不會影響磁珠的抗體結(jié)合效率。
l 高濃度的DTT、巰基乙醇、鹽酸胍等對本產(chǎn)品與標(biāo)簽蛋白的結(jié)合可能有一定影響，但Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液或NP-40裂解液等都完全適用。
l 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員科研使用。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
四．使用說明
1. 樣品的制備
a. 選擇合適的裂解液，用于制備細(xì)胞或組織的裂解液。需要確保裂解液的pH為6-8。
b. 具體的細(xì)胞或組織樣品裂解的制備步驟請參考裂解液的使用說明。制備好的裂解液上清宜置于冰上或4oC存放，隨后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、標(biāo)簽蛋白的純化等操作。新制備的樣品，建議盡量當(dāng)天完成免疫沉淀等后續(xù)操作，如樣品不能當(dāng)天使用，也可適當(dāng)分裝后-80oC凍存。
2. 兔IgG磁珠的準(zhǔn)備
由于兔IgG磁珠儲存在特殊保護(hù)液中，所以需要在加入樣品前適當(dāng)洗滌。
a. 用移液器輕輕吹打重懸兔IgG磁珠，按照每500μl樣品10μl或20μl磁珠懸濁液，取適量兔IgG磁珠至一潔凈離心管中，加入1×TBS至最終體積為約0.5ml。
b. 用移液器輕輕吹打重懸兔IgG磁珠。磁分離，去除上清。重復(fù)上述步驟兩次，因為保存液中有甘油也可適當(dāng)增加洗滌次數(shù)或者加大洗滌液體積。
c. 按照初始體積的量，用1×TBS重懸兔IgG磁珠。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
a. 加入磁珠與孵育。按照每500μl蛋白樣品加入10μl或20μl磁珠懸濁液的比例加入兔IgG磁珠，置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育2小時或4oC孵育過夜。注：孵育過程中，如果磁珠發(fā)生聚團(tuán)或呈片狀屬正常現(xiàn)象，不會影響實驗結(jié)果。
b. 磁分離。孵育完畢后，磁分離，去除上清。注：可保留部分上清液，用于檢測免疫沉淀的效果。
c. 洗滌。加入500μl的1×TBS，用移液器輕輕吹打重懸兔IgG磁珠。磁分離，去除上清。重復(fù)洗滌三次。注：也可通過檢測洗滌上清液的OD280來判斷是否洗滌完全，若OD280>0.05，應(yīng)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。
4. 洗脫
根據(jù)標(biāo)簽蛋白的特點及后續(xù)實驗要求，可以選擇如下3種方法之一進(jìn)行洗脫。以下以Anti-Flag磁珠為例，Anti-Flag磁珠采用一種方式洗脫時，兔IgG磁珠作為陰性對照，需要使用相同的洗脫方式。
a. 3×Flag競爭洗脫：本法為非變性法，洗脫效率高，且洗脫后蛋白保持原有生物活性，便于后續(xù)分析檢測。
(a) 3×Flag多肽洗脫液的配制：取適量3×Flag多肽(P9801)溶解于1×TBS中，使其終濃度為150μg/ml，或稀釋5mg/ml的3×Flag多肽溶液至150μg/ml。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl 3×Flag多肽洗脫液（150μg/ml），混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫?fù)u晃孵育30~60分鐘，或4oC孵育1~2小時。為了提高洗脫效率，可延長孵育時間或重復(fù)洗脫。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。上清即為洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白。
(d) 洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白置于4oC待用，或者-20oC或-80oC長期保存。
b. 酸性洗脫：本法為非變性法，比較快速且高效。洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測。
(a) 溶液的配制：酸性洗脫液（0.1M Glycine-HCl, pH3.0），中和液（0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl）。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl酸性洗脫液，混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育5分鐘。注：孵育時間不宜超過15分鐘。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并立刻加入10μl中和液，適當(dāng)混勻。
(d) 為了獲得最大的洗脫效率，可重復(fù)步驟b和c，并將相同樣品合并。
(e) 洗脫并中和的Flag標(biāo)簽蛋白置于4oC待用，或者-20oC或-80oC長期保存。
注1：酸性洗脫法雖然高效，但仍可能低于競爭洗脫法或SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法。
注2：由于目的蛋白的差異可能對酸性洗脫法的洗脫效率有一定的影響，如果對洗脫效率的要求比較高，可對酸性洗脫液的pH在2.5-3.1之間進(jìn)行一定的調(diào)整，相應(yīng)的中和液的pH值或量也要進(jìn)行一定的調(diào)整，例如100μl酸性洗脫液（0.1M Glycine-HCl, pH2.8）和15μl中和液（1M Tris-HCl, pH8.5）。
c. SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫：本法為變性洗脫法，得到的蛋白樣品適合SDS-PAGE電泳或WB檢測。
(a) SDS-PAGE上樣緩沖液的配制：參考《分子克隆》等配制5×或2×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，然后加入水配制成1×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。通常SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液含有DTT等還原劑，其洗脫得到的蛋白樣品中會含有Flag抗體的輕鏈和重鏈。
(b) 每10~20μl原始磁珠體積的磁珠，加入100μl 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，95oC加熱5分鐘。
(c) 置于磁力架上分離10秒，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳或Western檢測。
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