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羥基磷灰石修飾的磁珠（hydroxyapatite magnetic bead）是硅基磁珠經(jīng)羥基磷灰石官能團改性制得。 該珠子是非常有用的色譜介質，可用于快速純化和分餾各種生物物質，如蛋白質和抗體，無需繁雜的重復移液和離心。 羥基磷灰石有兩個不同的吸附位點; 與酸性基團結合的鈣位點和與堿性蛋白質基團相互作用的磷酸鹽位點。 由于其獨特的混合模式“離子交換特性，羥基磷灰石不僅具有獨特的分離性能，無與倫比的選擇性和分辨率，而且對蛋白質和抗體具有非常大的結合能力。 此外，羥基磷灰石不結合游離氨基酸或小肽，使其對蛋白質純化非常有利。
產(chǎn)品名稱
PuriMag Si-HA; PuriMag Si-[Ca5(PO4)3OH]2
濃度
50mg / ml
平均尺寸
0.4μm（+/-0.04μm）
材料
硅基磁性材料
磁分離
<30 S
儲存
2-8°C軟化水中
結合能力
>20ug protein (BSA)/mg bead
比表面積
~100m2/g
一、蛋白純化方案
注意：以下方案是采用PuriMag Si-HA羥基磷灰石修飾的磁珠純化蛋白質的實例。為獲最佳結果，用戶可用替代的結合、洗滌或洗脫緩沖液，并鼓勵根據(jù)注釋部分中描述的方案和建議確定最佳工作條件。我們建議進行滴定以優(yōu)化每種應用所需磁珠的量。 可相應地縮放洗脫體積以避免不必要的樣品稀釋。
l 建議將一水磷酸二氫鈉和七水合磷酸氫二鈉用于預處理緩沖液和結合/洗滌緩沖液配制。
l 避免使用無水磷酸鈉，因為這些鹽含有阻止一些大分子結合的焦磷酸鹽。
l 避免高濃度的鹽或螯合劑如EDTA，因為它們會阻止蛋白質與磁珠結合。
l 氯化鈣可以加入磷酸鹽緩沖液中以提高結合效率，用于酸性蛋白質純化。
磷酸鹽緩沖液中氯化鈣濃度: 0.3 mM calcium chloride for 10 mM phosphate buffers; 0.01 mM calcium chloride for 300 mM phosphate; 0.0075 mM calcium chloride for 400 mM phosphate.
l 預處理緩沖液: 200 mM Sodium phosphate, pH 9-10
l 結合/洗滌緩沖液: 10 mM Sodium phosphate, pH 6.8, 0.3 mM calcium chloride
l 洗脫緩沖液: Gradient of increasing concentration of 10-600 mM potassium phosphate, pH 7.0
A.樣品準備：將蛋白質樣品置于50倍體積的結合緩沖液進行透析。
B.磁珠準備 注意：用100 mM磷酸鈉，20%乙醇（磁珠濃度：50 mg / ml）懸浮磁珠，并在4℃下儲存.（可能需要非常輕柔地超聲處理珠子完全分散珠子。）
1）搖動瓶子，使磁珠完全重懸。將40μl磁珠（2mg）轉移到離心管中。磁分離，除去上清液。
2）用200μl預處理緩沖液重懸磁珠，室溫下2-3分鐘。磁分離，除上清液。重復該步驟一次。
3）從分離器中取出離心管，用200μl結合/洗滌緩沖液重懸磁珠。磁分離，除去上清液。重復該步驟一次。
4）用100μl結合/洗滌緩沖液重懸磁珠。
C.樣品結合
1）將含~40μg蛋白質的樣品加入上述洗過的磁珠中。用移液槍充分混合磁珠，在室溫下放置2-3分鐘。
2）將試管放在磁分離器上1-3分鐘，除去上清液。
3）取出離心管，用200μl結合/洗滌緩沖液洗滌磁珠。磁分離，除去上清液。.重復該步驟三次。
D.蛋白質洗脫：注意：蛋白質可用濃度逐漸增加的磷酸鹽緩沖液（10-600 mM）和/或pH梯度（5.5或更高，達到樣品蛋白質的穩(wěn)定性極限）或NaCl用于堿性蛋白質洗脫，但是不是酸性蛋白質。
1）從分離器中取出管子。用10-20μl洗脫緩沖液重懸珠子，并在室溫下放置3分鐘。
2）將管置于磁分離器上1-3分鐘，將含洗脫蛋白的上清液轉移到新離心管中。
二、DNA純化方案 注意：對于所有緩沖液配制，建議采用一水磷酸二氫鈉和七水合磷酸氫二鈉。避免使用無水磷酸鈉，因為這些鹽含有焦磷酸鹽，會阻止某些大分子結合。
l ?樣品裂解緩沖液：8M Guanidine hydrochloride
l ?結合/洗滌緩沖液：100 mM phosphate buffer pH 7, 4 M guanidine hydrochloride
l ?洗脫緩沖液：0.5M phosphate buffer pH 7 (4M guanidine hydrochloride -optional)
l ?稀釋緩沖液：0.2 M phosphate buffer pH 7
A.樣品準備：樣品預處理是成功純化高質量基因組的關鍵步驟。不同生物樣品需不同方法裂解細胞釋放DNA。許多培養(yǎng)的細胞可在裂解液渦旋均質化，而動物/植物組織、酵母和細菌需更嚴苛裂解過程。不同樣品參考下表。
Sample
Soft tissue
Hard tissue
Plant tissue
Fungi
Yeast
Bacterium
Liquid nitrogen
+
Frozen grinding
Homogenize
Lysozyme
Lyticase, zymolase
Sonication
Glass bead grinding
1）將100mg預處理的生物質溶于1ml樣品裂解液。為促進裂解，55℃搖床中下孵育1h至過夜。
2）在室溫下以13,000rpm離心3~5分鐘除去細胞碎片。將上清液轉移到新管中，用2×稀釋緩沖液將上清液濃度調至4M鹽酸胍。
B. 磁珠準備
1）搖動瓶子，重懸磁珠。將20μl-30μl磁珠（50mg / ml）轉移至離心管中。磁分離，除去上清液。
2）用200μl結合/洗滌緩沖液重懸磁珠。置于室溫下2-3分鐘。磁分離，除去上清液。重復該步驟三次。
3）用100μl結合/洗滌緩沖液重懸磁珠。
1）將樣品與磁珠混合，室溫下溫育10-15分鐘，同時輕輕旋轉。磁分離，除去上清液。
2）用200μl結合/洗滌緩沖液洗滌磁珠。磁分離，除去上清液。重復該步驟三次。
D. DNA洗脫：從分離器中取出離心管，用10-50μl洗脫緩沖液重懸磁珠，在室溫下放置3分鐘。磁分離，然后將含有洗脫DNA的上清液轉移到新試管中。
E. DNA沉淀
1）向洗脫的DNA溶液中加入等體積的d2H2O。加入0.1倍體積的5M乙酸銨和2.5倍體積的100%EtOH，使DNA在-20℃下沉淀至少15分鐘（優(yōu)選1小時或更長）。
3）以13,000rpm離心15分鐘。棄上清液。向沉淀中加入2ml冰冷的70％乙醇并輕彈/攪拌管以重懸沉淀。
4）以13,000rpm離心15分鐘。丟棄上清液。讓DNA風干（15分鐘即可）。將DNA重懸于適量的d2H2O或TE緩沖液中（注意：基因組DNA不易溶解，65°C下5分鐘有助于溶解）。
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