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      蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (post-translational modification，PTM)可以改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性、 介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境刺激的響應(yīng)往往通過PTM實(shí)現(xiàn)。PTM類型眾多，包括磷酸化、 乙?；?、泛素化和糖基化等．在眾多類型的 PTM 中，磷酸化是最受關(guān)注的。磷酸化修飾是一 種可逆的蛋白質(zhì)修飾，通過磷酸化修飾的變化，可以調(diào)控蛋白質(zhì)活性、影響信號(hào)傳遞過程。磷酸化修飾是細(xì)胞健康和疾病的核心調(diào)控機(jī)制之一，依靠眾 多種類激酶和磷酸酶，細(xì)胞可以迅速地增加或減少蛋白質(zhì)的磷酸化修飾，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜而精確地調(diào)控。真核生物中約有 1/3 的蛋白質(zhì)具有磷酸化修飾，這也體現(xiàn)了磷酸化修飾的普遍性和重要性。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在過去20年間發(fā)展迅速，多種生命過程都用磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了描繪．如對(duì)細(xì)胞周期的磷酸化解析、不同小鼠組織磷酸化差異譜圖、胰島素分泌機(jī)制等。此外，磷酸化蛋白質(zhì)組研究應(yīng)用于多種臨床問題研究，推動(dòng)了人們對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知，并提供了一系列臨床疾病治療靶點(diǎn)和治療方案。比如通過外泌體中蛋 白質(zhì)磷酸化篩選乳腺癌生物標(biāo)志物、通過小鼠腦不同區(qū)域G蛋白偶聯(lián)受體 (G protein-coupled receptor，GPCR)的激活研究藥效和藥靶等。 基于質(zhì)譜的自下而上(down-top)的蛋白質(zhì)組研究方法是常見的解析磷酸化蛋白質(zhì)組方法，下面重點(diǎn)討論下磷酸化肽段富集。
      磷酸化修飾肽段的豐度相對(duì)整體細(xì)胞而言是很低的，直接地全覆蓋質(zhì)譜檢測(cè)，非磷酸化的肽段會(huì)形成很高的背景信號(hào)，影響磷酸化肽段的檢測(cè)。因此磷酸化肽段的檢測(cè)，首先需要進(jìn)行富集；此外，對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離、分成多個(gè)組分，也是降低復(fù)雜程度、提高檢測(cè)深度的常用方法。

1. 富集方法分類 
      磷酸化肽段的富集方法，是整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中最多變的部分。磷酸基團(tuán)與金屬親和的方案是最流行的方案，其中應(yīng)用最廣泛的兩種是固相金屬離子親和色譜(immobilized metal affinity chromatograph， IMAC)和金屬氧化物親和色譜(metal oxide affinity chromatography，MOAC)。
      IMAC 建立時(shí)間約有20 年，利用過渡態(tài)金屬陽離子，如 Fe3+、Ga3+、 Zr4+ 等，作為親和試劑，與陰離子結(jié)合．Ti4+ 離子是該類試劑中新興的應(yīng)用。這些金屬陽離子通過螯合作用，固定在具有磁性的磁珠或硅顆粒上， 從而在去除非磷酸化肽段的過程中能夠保留磷酸化的肽段。廈門普睿邁格生物公司的IMAC磁珠（Ti螯合磁珠 MagStart-IMAC-Ti——蛋白質(zhì)組學(xué)前處理MagReSyn?-Ti-IMAC-生物磁珠專家、Zr螯合磁珠 MagStart-IMAC-Zr——高結(jié)合量蛋白質(zhì)組學(xué)前處理MagReSyn?-Zr-IMAC-生物磁珠專家、NTA磁珠 MagStart-NTA——高結(jié)合量蛋白質(zhì)組學(xué)前處理MagReSyn?NTA-生物磁珠專家）表現(xiàn)優(yōu)異，是最常用選擇。
      MOAC 方法建立約 10 年，利用氧化金屬可以和磷酸根基團(tuán)中的氧結(jié)合的特性進(jìn)行磷酸化肽段的富集。氧化鈦(TiOx)是最常用的 MOAC 試劑， 此外 Fe3O4 也比較常見。廈門普睿邁格生物公司的二氧化硅磁珠可特異富集磷酸化蛋白多肽（磷酸化多肽富集磁珠|硅基TiO2磁珠|二氧化鈦磁珠-生物磁珠專家）。
      IMAC 和 MOAC 方法都可以對(duì)磷酸化肽段或者蛋白質(zhì)進(jìn)行富集，二者都容易受到酸性肽段影響，比如多羧基集團(tuán)的肽段會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合。IMAC 所得樣品容易含有金屬離子或者金屬 鹽的污染，需要進(jìn)行脫鹽處理．并且 IMAC 方法對(duì)多磷酸化修飾的肽段具有偏好性，容易丟失單磷酸化修飾的肽段。和 IMAC 相比，MOAC 方法靈敏度更高、選擇性更好。由于金屬氧化物具有很好的穩(wěn)定性，因此 MOAC 方法對(duì) pH 值等環(huán)境因素的改變具有更好的耐受。 IMAC 和 MOAC 方法都是針對(duì)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾位點(diǎn)(pSer、pThr、pTyr) 進(jìn)行富集的方法。Matheron 等2014 年比較了兩種方法對(duì)HeLa 細(xì)胞中的磷酸化富集，發(fā)現(xiàn)只有 40%磷酸化肽段是重合的．不過，在肽段長(zhǎng)度、位點(diǎn)和模序(motif)等方面，二者并沒有明顯的不同。最重要的是，生物學(xué)的差異，而不是方法上的差異，對(duì)結(jié)果起到最主要的影響． 
      免疫共沉淀方法，是專門用于富集酪氨酸磷酸化的主流方法，結(jié)合了基于金屬的富集方法和基于 抗體的富集方法中的優(yōu)勢(shì)，該方法能夠高特異 性的對(duì)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行富集．目前，針對(duì)酪氨酸的特異性抗體正在不斷涌現(xiàn)． 

2. 富集方法的發(fā)展 
       肽段的檢測(cè)深度依賴于酶解效率、傳統(tǒng)的胰酶 (trypsin)酶解，能夠在賴氨酸和精氨酸的 C 末端進(jìn) 行剪切。但通過對(duì)不同酶的比較，發(fā)現(xiàn)兩種不同酶的酶切后，檢測(cè)到的磷酸化位點(diǎn)只有 1/3 的重合，這說明不同酶酶切后檢測(cè)到的位點(diǎn)不同。利用多種酶共同作用，可以提高酶切效率，提升檢測(cè) 的覆蓋深度。比如利用 LysC 和胰蛋白酶(trypsin) 共同酶解，可以提高 40%的磷酸化檢測(cè)位點(diǎn)。 預(yù)分離也是提高鑒定深度的方法。反向液相預(yù)分離(reversed phase liquid chromatograph，RPLC)是 常用的分組分方法，此外還有強(qiáng)陽離子交換(strong cation exchange，SCX)和強(qiáng)陰離子交換(strong anion exchange，SAX)方法。Ruprecht 等在比較不同 富集方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過親水強(qiáng)陰離子交換預(yù)分離， 48 h 的檢測(cè)可以獲得 15000 條磷酸化肽段，要比 4 h 檢測(cè) 5500 條磷酸化肽段的鑒定深度有所提 高。此外，覆蓋度的提升，使得數(shù)據(jù)間的相關(guān)性明顯提升。強(qiáng)離子交換方法可以和 TiOx 富集方法結(jié)合，但是還沒有和抗體富集方法結(jié)合的例子。 Batth 等在 2014 年比較了 SCX 和 RPLC 分組分方法，發(fā)現(xiàn) RPLC 方法能夠鑒定到更多的磷酸化肽段，RPLC 方法鑒定到 17 566 條磷酸化肽段， SCX 方法鑒定到 6215 條肽段。并且 RPLC 方法實(shí) 驗(yàn)流程更加簡(jiǎn)便，不用額外替換溶液環(huán)境。也有一些親和方法，用于富集磷酸化的蛋白質(zhì) 而非肽段．因?yàn)榈鞍踪|(zhì)常以復(fù)合物形式行使功能， 因此該方法能夠鑒定細(xì)胞中復(fù)合物的情況。如 Hoehenwarter 等利用 Al(OH)3 富集促細(xì)胞分裂劑激活的蛋白激酶．目前，該領(lǐng)域還在持續(xù)發(fā)展中。