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He, W., Wu, W., Li, Y., Liu, Q., Ren, P., Liu, H., & Chen, F. (2025). Next generation nanoparticle protein corona characterization methods. Nanomedicine, 1–3. https://doi.org/10.1080/17435889.2025.2460962

        納米顆粒 （NP） 因其獨(dú)特的特性而徹底改變了醫(yī)學(xué)、電子和材料科學(xué)。然而，生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是蛋白冠 （PC） 的形成，這會(huì)影響 NP 在體內(nèi)的行為和功效，NPs 在各種介質(zhì)中的演變和意外暴露過(guò)程中 PC 的意外形成對(duì)納米顆粒的毒性和安全性有重大影響。由低親和力軟蛋白冠和高親和力硬蛋白冠組成的 PC 響應(yīng)生物環(huán)境而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，使納米粒子相互作用的可預(yù)測(cè)性復(fù)雜化。因此，開(kāi)發(fā)用于 PC 表征的實(shí)時(shí)方法對(duì)于控制和優(yōu)化 NP 行為、推進(jìn)個(gè)性化醫(yī)療和靶向治療至關(guān)重要。

        傳統(tǒng)的 PC 表征方法，如凝膠電泳、質(zhì)譜和表面等離子體共振，為了解蛋白冠的組成和結(jié)構(gòu)提供了有價(jià)值的見(jiàn)解，但這些方法通常無(wú)法在實(shí)時(shí)體內(nèi)條件下捕捉蛋白質(zhì)-納米顆粒相互作用的動(dòng)態(tài)和異質(zhì)性。例如，它們通常依賴于通過(guò)離心從培養(yǎng)基中分離 NP 蛋白復(fù)合物，這會(huì)導(dǎo)致軟蛋白冠的損失。因此，這些技術(shù)無(wú)法完全反映生物系統(tǒng)中的實(shí)際 PC“指紋”。

        新一代技術(shù)通過(guò)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)原位分析來(lái)避免與分離步驟相關(guān)的干擾和蛋白質(zhì)損失。這些創(chuàng)新可以更準(zhǔn)確、更全面地了解 PC 的形成及其與生物系統(tǒng)的復(fù)雜相互作用。這一進(jìn)展的一個(gè)主要例子是 Niu 等人的工作，他們開(kāi)發(fā)了一種新穎的原位方法，用于使用納流式細(xì)胞術(shù) （NanoFCM） 在單納米顆粒水平上定量分析納米顆粒-蛋白質(zhì)相互作用，通過(guò)整合雙熒光定量技術(shù)，NanoFCM 可以提供有關(guān)血清等復(fù)雜生物基質(zhì)中蛋白質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)和納米顆粒聚集的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。這種方法使研究人員不僅可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)吸附，還可以監(jiān)測(cè)人血清中納米粒徑的演變。這代表了納米顆粒-蛋白質(zhì)相互作用的定量、原位表征的重大進(jìn)步，有望為設(shè)計(jì)更有效的納米藥物提供有價(jià)值的見(jiàn)解。Zentel 等人使用不對(duì)稱流場(chǎng)-流式分離從人血漿中分離 PC/NP 復(fù)合物，并使用 SDS-PAGE 和無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)表征富集的蛋白質(zhì)。這種方法可以防止離心過(guò)程中的 PC 損失。結(jié)果表明，盡管在大多數(shù)情況下有效緩解 PC 形成存在挑戰(zhàn)，但并非所有納米顆粒都會(huì)發(fā)展出顯著的 PC。具體來(lái)說(shuō)，PEG、pSar 和 pHPMA 包被的聚合物納米載體表現(xiàn)出最小的蛋白質(zhì)吸附，解釋了它們延長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間和潛在的臨床應(yīng)用 。

       對(duì)軟 PC 成分的實(shí)時(shí)分析提出了一個(gè)重大問(wèn)題。由于時(shí)間尺度較長(zhǎng)，以前的方法無(wú)法精確捕捉其動(dòng)態(tài)變化。值得注意的是，Zhang 等人在納米顆粒中開(kāi)發(fā)了一種納米粒子光催化接近標(biāo)記 （nano-PPL） 技術(shù)，用于 PC 的原位標(biāo)記，并在二級(jí)研究了 PC 的快速形成機(jī)制，納米 PPL 技術(shù)利用載有 Ce6 催化劑和生物素-酚探針的核殼納米顆粒進(jìn)行快速、精確的原位 PC 標(biāo)記。與傳統(tǒng)離心法（>30 秒）相比，納米 PPL 顯著提高了納米粒子-蛋白質(zhì)相互作用的時(shí)間分辨率，持續(xù)時(shí)間精度低至約 5 秒。作者發(fā)現(xiàn)，照射光敏探針 Ce6 可以激活生物素酚，從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的生物素化。自由基轉(zhuǎn)移是鄰近標(biāo)記的基本原理。因此，活化的生物素酚可以自由基的形式與周圍的蛋白質(zhì)反應(yīng)，并將生物素標(biāo)記附著在它們上面。最后，這些生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以使用鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行分離，并通過(guò)液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定和定量。在另一項(xiàng)研究中，研究人員使用 IRDye 680 NHS 酯快速標(biāo)記蛋白質(zhì)以對(duì) PC 進(jìn)行體內(nèi)追蹤，從而能夠觀察其動(dòng)態(tài)變化，原子力顯微鏡具有納米級(jí)分辨率，特別適合分析單分子生物共軛過(guò)程。這兩種技術(shù)的集成在 PC 動(dòng)力學(xué)的原位監(jiān)測(cè)方面具有巨大的潛力，可能代表一種很有前途的下一代表征方法。

        在另一項(xiàng)研究中，Baimanov 等人開(kāi)發(fā)了一種基于生物層干涉法 （BLI） 的快速捕魚(yú)策略，為納米顆粒表面的 PC 建立了一種原位和動(dòng)態(tài)分析方法，一旦手性 NP 與其連接，IgG 預(yù)包被的生物傳感器在生物樣品中孵育以形成 PC。用不同濃度的洗滌緩沖液洗脫和分離軟 PC 和硬 PC 的蛋白質(zhì)，并通過(guò)質(zhì)譜鑒定。這種方法允許實(shí)時(shí)監(jiān)控 PC 的形成、交換和解離過(guò)程。通過(guò)對(duì)多層 PC 的組分進(jìn)行原位和快速洗脫，它實(shí)現(xiàn)了軟硬 PC 的高效分離、鑒定和時(shí)間分辨動(dòng)力學(xué)研究。這種原位分析方法也適用于超小、低密度納米顆粒的 PC 研究。此外，該研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)總結(jié)了過(guò)去幾年開(kāi)創(chuàng)的納米 PC 分析和表征方法，并將其匯編成一本詳細(xì)而全面的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，優(yōu)化的工作流程涵蓋了所有過(guò)程，例如納米生物分子蛋白冠的形成、制備、定量、成分鑒定、原位表征和動(dòng)態(tài)相互作用。該技術(shù)解決方案結(jié)合了多種不同的分析方法，例如電子顯微鏡、質(zhì)譜、同步輻射分析方法、分子相互作用分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬，有助于全面和系統(tǒng)地表征納米生物分子蛋白冠的物理化學(xué)性質(zhì)、成分和原位動(dòng)力學(xué)相互作用。該實(shí)驗(yàn)手冊(cè)詳細(xì)總結(jié)了上述分析方法的優(yōu)化實(shí)施方案，為納米生物分子蛋白冠的綜合分析提供了有價(jià)值的研究策略。它不僅適用于闡明納米生物分子蛋白冠的形成、進(jìn)化和動(dòng)態(tài)相互作用過(guò)程，而且為揭示納米生物界面對(duì)納米材料復(fù)雜的化學(xué)和生物效應(yīng)的機(jī)制提供了有效的研究工具，在納米科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)和環(huán)境科學(xué)等眾多研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

        PC 的體內(nèi)表征長(zhǎng)期以來(lái)一直是一個(gè)基本未被探索的領(lǐng)域，但它在確定 NP 在生物系統(tǒng)中的行為方面起著至關(guān)重要的作用。最近，Latreille 等人提出了一種新的理論框架，用于定量評(píng)估蛋白質(zhì)對(duì) NPs 的原位吸附，并在熒光成像模式下使用差分動(dòng)態(tài)顯微鏡 （DDM） 監(jiān)測(cè) NPs 的聚集 [DDM 可以同時(shí)監(jiān)測(cè) NP 的大小和聚集，通過(guò)量化這種聚集，它可以應(yīng)用于復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)吸附可以觸發(fā)顆粒聚集，并且該方法可以進(jìn)一步量化形成的聚集結(jié)構(gòu)。研究表明，蛋白質(zhì)對(duì)聚苯乙烯 NPs 的親和力與顆粒濃度有關(guān)。對(duì)于復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，本研究發(fā)現(xiàn) PC 的組成隨血清蛋白的稀釋而變化，從而證明了從未在 NP 上原位定量評(píng)估過(guò)的 Vroman 效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DDM 可以監(jiān)測(cè) PC 在體內(nèi)的變化。斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)中 PC 的組成隨著時(shí)間的推移發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步證實(shí)了 PC 的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。本文為納米顆粒與生物分子相互作用的研究提供了一種新的定量分析工具，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其在體外和體內(nèi)應(yīng)用中的有效性，為納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了重要的參考。盡管 DDM 在研究納米顆粒和蛋白質(zhì)之間的相互作用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，但它也面臨著一些限制，例如高濃度樣品、非球形顆粒、熒光猝滅、動(dòng)態(tài)范圍、實(shí)驗(yàn)條件和數(shù)據(jù)處理方面的挑戰(zhàn)。在應(yīng)用 DDM 時(shí)，應(yīng)根據(jù)具體的研究對(duì)象和條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化。

      使用計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)納米材料上的 PC 的研究是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。Huzar 等人表明 DNA 納米結(jié)構(gòu)的工程改造可以通過(guò)非 DNA 修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且在較小程度上可以通過(guò)改變 DNA 結(jié)構(gòu)本身來(lái)實(shí)現(xiàn)，他們的機(jī)器學(xué)習(xí)模型在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)吸附在 DNA 納米結(jié)構(gòu)上的準(zhǔn)確率達(dá)到了 92%。該 AI 工具可幫助研究人員預(yù)測(cè)蛋白冠組成，優(yōu)化生物物理和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的 DNA 納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。然而，需要對(duì)高分辨率成像和生化分析進(jìn)行進(jìn)一步研究，以補(bǔ)充機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)。

       用于 PC 的下一代表征方法的開(kāi)發(fā)為推進(jìn)納米醫(yī)學(xué)和納米生物技術(shù)領(lǐng)域帶來(lái)了巨大的前景。然而，這些下一代表征技術(shù)的開(kāi)發(fā)必須解決幾個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括克服高成本帶來(lái)的限制、對(duì)先進(jìn)設(shè)備的需求以及實(shí)時(shí)捕獲動(dòng)態(tài)變化的困難。此外，體內(nèi) PC 的原位檢測(cè)仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。為了解決這些障礙，各種新興技術(shù)的組合，如實(shí)時(shí)成像、多模態(tài)傳感和先進(jìn)的計(jì)算工具，有望帶來(lái)突破。另一個(gè)重要的考慮因素是來(lái)自各個(gè)領(lǐng)域的研究人員之間需要跨學(xué)科合作，包括納米材料、生物學(xué)、物理學(xué)和計(jì)算科學(xué)。此類合作對(duì)于開(kāi)發(fā)更有效和通用的表征技術(shù)至關(guān)重要。隨著我們朝著這個(gè)方向前進(jìn)，不同技術(shù)的整合無(wú)疑將增強(qiáng)我們對(duì) PC 的理解，從而為針對(duì)廣泛疾病的更加個(gè)性化和有針對(duì)性的治療鋪平道路。普睿邁格提供蛋白冠富集磁珠 http://www.5000js.com/Product/8096211554.html