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鏈霉親和素在生物診斷中應(yīng)用簡(jiǎn)介

來(lái)源:生物磁珠專家 2018-1-5 20:53:24??????點(diǎn)擊:



一、鏈霉親和素性質(zhì)
鏈霉親和素streptavidin,SA)是由鏈霉菌streptomyces avidinii分泌的一種蛋白質(zhì),分子量為54kD。鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成,其氨基酸組成中,甘氨酸和丙氨酸的含量較大,而且結(jié)合生物素的活性基團(tuán)也是肽鏈中的色氨酸殘基;鏈霉親和素是一種稍偏酸性(pH6.0)的蛋白質(zhì),并且不帶任何糖基。

鏈霉親和素分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個(gè)生物素,因此與親和素一樣,一個(gè)鏈霉親和素分子也能結(jié)合4個(gè)生物素分子,二者親和常數(shù)(K)亦為1015L/mol。在蛋白水解作用下,鏈霉親和素可在N端10~12和C端19-21間斷裂,形成的核心鏈霉親和素仍然保持完整的結(jié)合生物素的能力。鏈霉親和素的活性單位也是以結(jié)合1μg生物素所需的量來(lái)表示,1mg鏈霉親和素的最高活性可達(dá)18U。

 
二、親和素(AV)和鏈霉親和素SA)的比較
相同點(diǎn)
1、 生物素結(jié)合能力:AV:13~15U,SA:14~18U
2、 活性中心依賴于色氨酸-懶氨酸:親和素在氨基酸序列的70-70和110-111兩個(gè)位點(diǎn)有色氨酸-懶氨酸,鏈霉親和素在氨基酸序列的79-80和120-121兩個(gè)位點(diǎn)含有色氨酸-懶氨酸。
 
不同點(diǎn):
1、 分子量:AV=66KD, SA=54KD
2、 等電點(diǎn):AV=10.5, SA=6.0, AV帶正電較多,非特異性結(jié)合較強(qiáng)。
3、 位阻效應(yīng):SA的生物素結(jié)合位點(diǎn)較AV深,位阻效應(yīng)較強(qiáng),長(zhǎng)臂生物素更適合。
4、 生物素的結(jié)合:AV隨機(jī)結(jié)合,SA協(xié)同結(jié)合。
5、 氨基酸序列:AV含二硫鍵和10%糖,SA含甘氨酸丙氨酸較多,無(wú)糖和二硫鍵。
 
三、鏈霉親和素在ELISA中的應(yīng)用

聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑:

①固相的抗原或抗體,②標(biāo)記的抗原或抗體,③作用的底物。

根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。


生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式:
1、用于間接包被:可以在固相上先預(yù)包被鏈霉親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合,通過(guò)鏈霉親和素-生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原間接包被。這種包被法主要有以下優(yōu)點(diǎn):
① 增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。
② 陰性對(duì)照、空白對(duì)照本底低,檢測(cè)敏感性高。
③ 鏈霉親和素替代抗體包被微孔,避免了抗體包被微孔時(shí)容易發(fā)生失活(或不易保存)。
④ 通過(guò)生物素將抗體結(jié)合于鏈霉親和素包被的標(biāo)板上,可克服傳統(tǒng)物理吸附方法造成的抗原抗體結(jié)合能力大量喪失的不足。

⑤ 生物素標(biāo)記捕獲抗體、標(biāo)指示抗體和樣品中的抗原三者在均相中形成復(fù)合物后,再通過(guò)生物素結(jié)合于鏈霉親和素包被的標(biāo)板上,由于鏈霉親和素和生物素之間親和力極強(qiáng),并且具有高度的特異性和穩(wěn)定性,因而可提高檢測(cè)靈敏度。

實(shí)例:CTnT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,雙抗體夾心ELISA法最低檢測(cè)值為7.25μg/L,使用鏈霉親和素包被法最低檢測(cè)值達(dá)到1.0μg/L,較雙抗體夾心ELISA法靈敏度提高7倍。

 

2、   用于終反應(yīng)放大:在常規(guī)ELISA中的標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代,然后連接親和素-結(jié)合物,以放大反應(yīng)信號(hào)。

由于SA的等電點(diǎn)低,表面帶的正電荷少,因此它和聚苯乙烯板載體的靜電吸附力弱,SA的陰性對(duì)照顯色明顯比AV低,這樣在ELISA上應(yīng)用SA可進(jìn)一步提高方法的靈敏度。鏈霉親和素對(duì)生物素化的抗體是一個(gè)主動(dòng)的吸附過(guò)程,生物素化的抗體吸附在鏈霉親和素表面,抗體排列整齊,分布均勻,抗體容易保持功能,而被動(dòng)吸附抗體排列極不規(guī)則容易導(dǎo)致大量抗體失去功能,所以將生物素-鏈霉親和素免疫反應(yīng)系統(tǒng)引入競(jìng)爭(zhēng)法中,可以大大提高聯(lián)免疫的靈敏度和特異性。

實(shí)例1: 地高辛的生物素-鏈霉親和素免疫法測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,傳統(tǒng)方法被動(dòng)吸附只有約5% 的抗體具有功能 ,生物素-鏈霉親和素體系中60% 的抗體具有功能。
實(shí)例2:淋球菌抗原測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)中,生物素-鏈霉親和素法檢測(cè)靈敏度為0.625 μg/L,相當(dāng)于3.5×104/ml淋球菌,而同時(shí)進(jìn)行常規(guī)ELISA測(cè)定時(shí),其靈敏度為1.25 μg/L。
 
四、鏈霉親和素相關(guān)商品
1、 標(biāo)記化鏈霉親和素
或熒光素等修飾鏈霉親和素,應(yīng)用于ELISA放大檢測(cè)信號(hào),提高檢測(cè)靈敏度。
產(chǎn)品實(shí)例:
① 綠色熒光素(FITC)標(biāo)記Streptavidin蛋白
② 辣根過(guò)氧化物標(biāo)記鏈霉親和素

2、 鏈霉親和素標(biāo)板
鏈霉親和素直接或間接預(yù)包被在標(biāo)板上,穩(wěn)定性高,易于保存,使用時(shí)只要加入生物素化的抗體或者抗原即可。

3、 鏈霉親和素磁珠
鏈霉親和素磁珠由超順磁微粒與高純度鏈霉親和素共價(jià)結(jié)合而成。磁珠可用于捕獲生物素標(biāo)記的底物,包括生物素標(biāo)記的抗原、抗體和核酸。由于生物素-鏈霉親和素的相互作用很強(qiáng),其結(jié)合常值(Ka)為 1015 M-1,并且鏈霉親和素的非特異性結(jié)合率很低,使得被捕獲的底物可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求,包括 mRNA 的分離和一抗、二抗的獲得。

產(chǎn)品實(shí)例:
PuriMag G-Streptavidin鏈霉親和素磁珠
產(chǎn)品描述:
親和素包被的PuriMag G磁珠為分離生物素抗體、核酸或其他生物素配體和靶分子的最佳選擇。這種鏈親和素-生物素的高親和力 ( Kd值10-15 )在分子上有著廣闊的應(yīng)用。磁珠是單層而不是多層的鏈親和素重組體。這對(duì)自由生物素或生物素配體和靶分子而言,在空間排列有著絕大多數(shù)的生物素結(jié)合位點(diǎn)。沒有過(guò)量的物理吸附鏈親和素確保了只有微量的鏈親和素會(huì)遺漏。批次間變化小,結(jié)果重復(fù)性好。
優(yōu)點(diǎn)和特性:
? 直接快速捕獲任何生物素靶分子
? 靈活的固相操作和優(yōu)化的液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
? 磁性操作易于適應(yīng)自動(dòng)化平臺(tái)
? 批次重復(fù)性高,結(jié)果可靠一致

應(yīng)用:
PuriMag G-Streptavidin已達(dá)到了前所未有的廣泛應(yīng)用。主要應(yīng)用在制備單鏈DNA模板,分離RNA和DNA結(jié)合蛋白,固定長(zhǎng)鏈DNA片段,純化測(cè)序產(chǎn)品,特效捕獲核酸。
濃度:10mg/ml
儲(chǔ)存條件:2-8
結(jié)合能力:
磁珠的結(jié)合能力由DNA片段長(zhǎng)度決定。 1mg磁珠結(jié)合4,000 pmoles自由生物素,400 pmoles生物素標(biāo)記的核苷酸(單鏈) ,10 - 20μg生物素標(biāo)記抗體和10 pmoles的2 - 4 kb雙鏈DNA片段。
英文名稱:PuriMag G-Streptavidin

中文名稱:PuriMag鏈霉親和素磁珠

更多請(qǐng)參考:http://www.5000js.com/Product/8271042221.html

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