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Gharibi, H., Ashkarran, A.A., Jafari, M. et al. A uniform data processing pipeline enables harmonized nanoparticle protein corona analysis across proteomics core facilities. Nat Commun 15, 342 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-023-44678-x

摘要       蛋白冠是在生物體液中的納米顆粒上動態(tài)形成的一層主要由蛋白質組成的生物分子層，對于預測納米藥物的安全性和有效性至關重要。蛋白冠的蛋白質組成通常使用液相色譜-質譜法 （LC-MS/MS） 進行分析。我們最近的研究涉及由 17 個蛋白質組學機構分析的相同樣本，強調了顯著的數據變異性，在這些中心中只有 1.8% 的蛋白質被一致鑒定出來。在這里，我們實施了一個聚合數據庫搜索，統(tǒng)一了可變修飾、酶特異性、允許的漏診切割次數以及蛋白質和肽水平上嚴格的 1% 錯誤發(fā)現率等參數。這種統(tǒng)一的搜索極大地協(xié)調了蛋白質組學數據，提高了可重復性和不同核心中一致性鑒定的獨特蛋白質的百分比。具體來說，在 717 種定量蛋白質中，253 種 （35.3%） 在前 5 家檢測中心共享（16.2% 在前 11 家檢測中共享）。此外，我們注意到還原和烷基化是蛋白冠樣品處理中的重要步驟，正如預期的那樣，省略這些步驟可將總定量肽的數量減少約 20%。這些發(fā)現強調了蛋白冠分析中標準化程序的必要性，這對于推進納米級生物技術的臨床應用至關重要。

簡介

       納米顆粒一旦暴露于生物體液中，其表面就會迅速被一層離子和各種類型的生物分子的層覆蓋，稱為生物分子/蛋白冠。蛋白冠的組成，就參與蛋白質的類型、豐度和修飾而言，決定了生物系統(tǒng)（例如細胞）如何感知納米顆粒并對其做出反應。最近對蛋白冠領域 2,134 篇已發(fā)表的論文進行的聚類分析揭示了納米顆粒蛋白冠的蛋白質組學分析存在很大異質性（例如，就已鑒定的獨特蛋白質的數量而言）;因此，非常需要開發(fā)標準化方法/方案，以改善各種實驗室/核心中納米顆粒蛋白電暈的蛋白質組學表征。

       基于質譜的蛋白質組學通常會產生可重復的數據（reproducible data），在不同實驗室進行的類似實驗之間的主要區(qū)別在于給定樣品中定量的蛋白質數量（即蛋白質組覆蓋率）。因此，在蛋白質組覆蓋率低的情況下，缺乏對低豐度真實靶標的檢測可能會產生偏倚，因此可能會選擇不太重要的靶標候選者進行后續(xù)分析。生物體液（例如血漿/血清）的蛋白質組學分析以及（血漿/血清）蛋白冠的分析都說明了這個問題，因為蛋白冠層中蛋白質的存在與否會導致數據誤解或缺少生物標志物。蛋白冠的分析面臨與血漿蛋白質組學類似的挑戰(zhàn)，主要包括寬動態(tài)范圍，即 22 種蛋白質占血漿蛋白質重量的 99%，來自此類蛋白質的肽擠滿了質譜，阻礙了蛋白質組的深入分析，特別是對于豐度相當低的蛋白質。此外，另一個分析難點是血漿中存在不同的蛋白質亞型。事實上，已經開發(fā)了使用納米顆粒蛋白冠的新興技術，用于降低生物標志物發(fā)現中給定生物體液的生物學復雜性。盡管存在這些挑戰(zhàn)，科學家們還是定量了血漿中數千種蛋白質，從而發(fā)現了不同的基于疾病的生物標志物。

       雖然血漿蛋白質組學在不斷改進，但在樣品制備以及數據提取、清潔和處理方面，不同蛋白質組學研究的標準化嘗試有限。然而，已經討論了有關研究設計、血漿樣品采集、質量保證、樣品制備、MS 數據采集、數據處理和生物信息學以及蛋白質組學實驗的最低報告要求的注意事項和建議。
       給定核心測試機構報告的蛋白冠的質量和蛋白質組覆蓋率可能會受到樣品制備方案、分析柱、液相色譜 （LC） 系統(tǒng)和質譜 （MS） 儀器以及方法參數和分析持續(xù)時間的影響。其他變異來源包括原始文件的數據庫搜索平臺、搜索設置、錯誤發(fā)現率 （FDR） 的控制、翻譯后修飾的包含以及使用的序列數據庫。
       為了研究從不同測試中心獲得的蛋白冠數據的異質性程度和來源，我們將相同的蛋白冠樣品發(fā)送到不同的液相色譜-質譜 （LC-MS/MS） 核心測試設施，并分析其報告的結果。更具體地說，哈佛大學、斯坦福大學、麻省理工學院 （MIT）、凱斯西儲大學、韋恩大學、伊利諾伊大學、康奈爾大學、田納西大學、內布拉斯加大學林肯分校 （UNL）、密蘇里大學、辛辛那提大學、佛羅里達大學、堪薩斯大學醫(yī)學核心 （KUMC） 的中心分析了 17 個相同的蛋白冠樣品等分試樣， 德克薩斯大學圣安東尼奧分校 （UTSA）、密歇根州立大學 （MSU）、加州大學圣地亞哥分校 （UCSD） 和內華達大學里諾分校 （UNR）。分析分 3 個技術重復進行。沒有提供或要求標準操作程序;相反，要求核心設施按照通常的做法分析樣品。此后，我們用隨機數（與之前的研究4 中的數字相同）對核心設施名稱進行盲法，以防止任何潛在的利益沖突。實驗方案的基本詳細信息可在補充表 1 中找到。我們已經向所有中心索取了詳細的方案，這些方案可以在我們原始研究4 的補充信息中找到。
       在這項研究中，我們探討了數據庫搜索、數據提取、處理和分析對觀察到的數據異質性的影響。具體來說，我們研究了采用具有統(tǒng)一參數（包括受控 FDR）的聚合數據庫搜索是否有助于標準化和協(xié)調結果。

結果

       我們對來自 15 個使用 Orbitrap 檢測器的中心的 LC-MS/MS 原始文件進行了統(tǒng)一的數據庫搜索（整個工作流程如圖 2 所示）。中心 6 被排除在搜索之外，因為樣品是通過 Bruker timsTOF-PRO 儀器分析的。中心 8 也被排除在外，因為丙烯酰胺用于半胱氨酸 （Cys） 殘基的烷基化，而其他中心使用碘乙酰胺 （IAA） 或跳過烷基化步驟。由于幾個中心沒有說明是否進行了蛋白質的還原和烷基化，我們將 Cys 氨基甲基化作為可變修飾，并在蛋白質定量中使用氨基甲基化肽。雖然一些中心在其單獨的數據庫搜索中包括了其他修飾，例如脫酰胺化和磷酸化，但我們只將蛋白質 N 末端的常規(guī)蛋氨酸氧化和乙?；鳛榭勺冃揎?，因此結果在中心之間具有可比性。在蛋白質和肽水平上應用 1% 的 FDR，類似于以前的研究。如補充表 1 所示，不同的中心在蛋白質和/或肽水平上使用 1-10% 的 FDR，而一些中心沒有說明 FDR 信息。以前一些中心使用半特異性檢索，而這里我們只檢索特異性胰蛋白酶肽。我們也最多只允許兩次漏診，這是相當標準的，并且在社區(qū)中被廣泛接受。而以前幾個中心在他們的個人搜索中允許多達 3-5 個遺漏的卵裂。值得注意的是，我們只強調參數中的這些變化是異質性的來源，并且只應用社區(qū)廣泛接受的參數（例如，不超過 1% 的 FDR。這不會破壞由不同核心測試中心單獨執(zhí)行的先前數據庫搜索的有效性。整個工作流程如圖 1 所示。

將納米顆粒與血漿一起孵育以形成蛋白冠。然后將樣品分成 17 個相同的等分試樣，并提交給美國各地的 17 個不同的核心設施，如參考文獻 4 所述。在這項研究中，對原始文件進行了單獨檢查。還仔細檢查了這些協(xié)議，以確定可以在統(tǒng)一數據庫搜索中處理的原始文件。然后使用最新版本的 MaxQuant 和最新的 fasta 文件對來自 15 個中心的原始數據進行搜庫。然后提取、清理和分析數據，如下所述。經參考文獻 4 許可，此處復制了電暈涂層納米顆粒的 TEM 圖像。m/z 質荷比，LC-MS 液相色譜與質譜聯用。

統(tǒng)一數據庫搜索顯著提高了不同測試中心數據的均一性

       去除污染物后，統(tǒng)一數據庫搜索確定了 1,335 種蛋白質（補充數據 1）。與此同時，從不同核心設施中單獨搜索的數據集的匯編導致鑒定了 4022 種蛋白質。我們認為，在之前的研究中鑒定出的蛋白質數量明顯增加，部分原因是缺乏在蛋白質和肽水平上應用嚴格的 FDR，以及使用不同的搜索引擎、序列數據庫和其他搜索參數，例如可變的翻譯后修飾、酶特異性和允許的遺漏切割的數量。
       每個核心設施定量的蛋白質數量如圖 2 所示。2a 并與之前研究中檢測到的蛋白質進行了比較。正如預期的那樣，由于統(tǒng)一搜索，所有中心的蛋白質數量都減少了。與我們的統(tǒng)一搜索相比，應用不太嚴格的 FDR、半特異性數據庫搜索、包含具有兩個以上缺失切割的肽以及包含非常規(guī)修飾（如磷酸化）預計將產生更多的蛋白質。因此，與單個數據庫搜索中檢測到的蛋白質數量相比，在統(tǒng)一搜索中，使用上述四個參數執(zhí)行數據庫搜索的中心定量蛋白質的數量減少了更多。


       總體而言，定量了 717 種蛋白質，其中 51 種 （7.1%） 在所有中心之間共享（補充數據 2），在所有重復中發(fā)現了 31 種 （4.3%） 蛋白質（補充數據 2 中蛋白質的NA_count_all_replicates為零）（圖 2）。在之前的研究中，只有 1.8% 的蛋白質組在 12 個核心設施之間共享。正如預期的那樣，所有中心之間共享的大多數蛋白質具有相對較高的豐度、更高的檢測到的肽數量和更高的序列覆蓋率（圖 D）。2c;例如，紅色和黃色圓圈表示 100% 和 80% 的核心設施定量的蛋白質）。15 個核心的蛋白質水平強度分布如圖 1 所示。我們還將所有核心設施中的 51 種共享蛋白質映射到 KEGG 通路，富集的通路如圖 2 所示。


由納米顆粒蛋白電暈中的 15 個核心設施累積量化的 717 種蛋白質的分層聚類如圖 1 所示。4a. 圖 1 中的 PCA 分析4b 還顯示，主成分 1 按每個核心設施的定量蛋白質數量來分離數據。總體而言，核心主要根據定量蛋白質的數量分為 3 個簇 A、B 和 C。然后，我們計算了每個簇的共享蛋白數量。雖然集群 A 核心設施共享 253 種蛋白質，但集群 B 和 C 分別共享 122 和 57 種蛋白質（圖 D）。因此，雖然 35.3% 的蛋白質在集群 A 的 5 個核心設施之間共享，但集群 B 中 6 個核心設施的相應數字為 17%，集群 C 中的 4 個核心設施為 7.9%。為了與之前的研究4 進行偏差較小的比較，我們計算了簇 A 和 B 中中心的共享蛋白（總共 11 個中心）。簇 A 和 B 共享 116 個蛋白質 （占所有蛋白質的 16.2%）。與我們原始研究中 12 個中心之間 1.8% 共享蛋白質相比，這提高了 9 倍。

a 在 15 個核心設施的相同納米顆粒蛋白電暈中定量的 717 種蛋白質的歸一化強度的分層聚類。b 由 15 個核心設施定量的蛋白質組的 PCA 分析。c 在數據集的分層聚類和 PCA 分析中確定的不同簇中共享蛋白質的數量。面板 a-c 中的紅色、藍色和綠色是指中心簇。d 蛋白質強度在不同簇中的分布。箱線圖：中心線，中位數;箱子限制包含 50%;上四分位數和下四分位數，75% 和 25%;maximum， 最大值（不包括異常值）;最小值，最小值，不包括異常值;異常值，是上四分位數和下四分位數的 1.5 倍以上。e 在面板 a 中觀察到的不同參數對聚類的影響。f 從每個核心設施獲得的數據中至少包含一個 Cys 殘基的肽的百分比（每個條形頂部的數字表示含 Cys 的肽的實際數量）。g 含 Cys 的肽數與總肽數的關系。h 含有 His 殘基的肽數與肽總數的關系。所有分析均基于平均 3 個技術重復。

       共享蛋白質在每個簇的核心設施之間的蛋白質水平強度分布如圖 2 所示。4d，表明簇 C 的核心設施主要定量了樣品中最豐富的蛋白質（簇 C 中共享蛋白質的平均蛋白質強度高于 B，反過來，B 的平均蛋白質強度高于簇 A）。這些結果表明，某些核心設施在定量低豐度蛋白質和達到更高的蛋白質組覆蓋率方面優(yōu)于其他設施。與我們之前的研究相比，這些發(fā)現表明，統(tǒng)一的數據庫搜索極大地增加了不同核心設施之間共享蛋白質的數量，并且可以以無偏倚的方式比較每個中心的性能。假設，如果應用其他統(tǒng)一搜索參數，共享蛋白質也會增加。

       為了進一步檢查可能導致圖 1 中觀察到的聚類的其他因素。4a 中，我們調查了每個集群中內核使用參數的次數。如圖 1 所示。4e 中，所用 MS 系統(tǒng)、消解模式以及包含還原和烷基化步驟方面存在聚類趨勢?？傮w而言，高端（最近推出的）質譜儀在提供最高的蛋白質組覆蓋率方面表現出色，但也有一些例外。意料之中，由于樣品損失較低，磁珠上消化（盡管并非在所有情況下）總體上提供了比溶液內或凝膠內消化更高的蛋白質組覆蓋率，這可能解釋了為什么更多的核心機構根據他們的經驗選擇磁珠上消化。我們還研究了其他參數（包括梯度持續(xù)時間、變量修飾、液相色譜系統(tǒng)和 FDR）對圖 1 中聚類的影響。4a. 但是，這些參數都沒有對聚類產生明顯影響。
       Cys 殘基占蛋白質組中氨基酸的 2.3%，因此，≈20% 的所有胰蛋白酶肽至少包含一個 Cys21。在沒有還原和烷基化的情況下，這些肽在消化過程中或消化后交聯，并且大多數在清潔過程中被消除和/或通過常規(guī)數據庫搜索未找到。因此，這些肽無法通過常規(guī) LC-MS/MS 分析進行鑒定/定量。由于 6 個核心設施在提供的方案中未顯示 Cys 還原和烷基化（中心 1、2、4、5、13 和 17），我們還計算了不同中心的定量含 Cys 肽的數量。如圖 1 所示。4f 中，在其方案中包括還原和烷基化步驟的中心圍繞預期的含 ~20% Cys 的肽進行定量。另一方面，上述 6 個中心未能量化此類肽。預計含 Cys 的肽數與總肽計數之間具有良好的相關性。在執(zhí)行 Cys 殘基還原和烷基化的中心中觀察到這種相關性，但在跳過此步驟的 6 個中心中未觀察到這種相關性（圖 D）。作為對照，我們繪制了含組氨酸 （His） 的肽的數量與肽總計數的關系，證明了近乎完美的相關性（圖 D）。4h）。我們選擇了 His，因為 His 在蛋白質組中的頻率非常接近 Cys 殘基21。有趣的是，跳過還原和烷基化步驟的 4 個中心屬于圖 A 中的簇 A。4a 中，它量化了最多的蛋白質。然而，即使在這些情況下，數據質量（每個蛋白質的肽數和序列覆蓋率）以及蛋白質組覆蓋率也可以通過納入含 Cys 的肽來進一步提高?？偟膩碚f，這一發(fā)現表明，在LC-MS/MS工作流程中包括Cys還原和烷基化步驟以防止數據丟失是必要的。

不同檢測中心蛋白質組學數據的全局相似性
       然后，我們計算了 15 個中心共享的 51 種蛋白質之間的相關性（圖 D）。5）. 這種無偏分析表明，對于一致定量的蛋白質，所有核心都報告了高度可比的數據。大多數核心設施的數據通常顯示與其他設施的相關系數高于 0.7。只有來自 11 個核心的數據通常與其他設施的數據顯示出低于 0.7 的相關性，我們無法將其歸因于單個參數，例如消解時間、儀器類型、數據庫搜索等。可接受的相關水平表明，來自每個核心的數據可以在給定的蛋白質組覆蓋度內進行驗證，并且數據的可變性主要源于不同的蛋白質組覆蓋度。雖然LC-MS/MS方案和工作流程也可能產生差異，但本文表明，在蛋白質和肽水平上執(zhí)行統(tǒng)一和標準的數據庫搜索并嚴格控制FDR，可以顯著協(xié)調不同核心設施的數據。


每個核心的 3 個技術重復的平均歸一化強度用于相關性分析。相關系數以黑色文本給出，核心代碼以黑色粗體文本表示，位于框的右上角。表示顯著性低于 p 值 0.001（雙側），并且源自 Pearson 相關分析。

討論

       本研究的結果表明，使用統(tǒng)一且更標準的數據庫搜索有助于在不同核心設施中均勻化蛋白冠分析的結果?？缰行臋z測到的蛋白質從 4,022 個減少到 1,335 個（定量）蛋白質，這表明數據庫搜索參數設置對搜索結果有顯著影響。統(tǒng)一的數據處理和分析增加了不同中心之間共享蛋白質的數量，并通過統(tǒng)一序列數據庫、搜索參數和數據清理來提高數據可重復性。我們還表明，雖然共享蛋白質的豐度在不同中心之間通常具有良好的相關性，但變異性的主要來源來自不同程度的蛋白質組覆蓋。在這種情況下，蛋白質組覆蓋率在很大程度上取決于 LC-MS/MS 方案、工作流程、LC 和 MS 儀器、數據提取和處理。我們進一步證明，還原和烷基化是樣品制備中必不可少的步驟，跳過此步驟會導致肽水平數據丟失 20%。缺乏對含 Cys 肽的檢測會影響蛋白質序列覆蓋率和每種蛋白質肽數方面的蛋白冠分析質量。我們進一步證實，提供較低蛋白質組覆蓋率的中心主要量化了蛋白冠中更豐富的蛋白質。蛋白質組覆蓋度在蛋白冠研究中非常重要，因為每種蛋白質的存在與否最終都會影響生物標志物的選擇。
       分析表明，LC-MS/MS方案、工作流程、LC和MS儀器、數據提取和處理中的多個變量可以解釋給定中心優(yōu)于其他中心的原因。MS 儀器、消化模式以及包含還原和烷基化步驟是當前研究中影響蛋白質組覆蓋率的變量之一。然而，有時，即使是幾個跳過 Cys 還原和烷基化步驟的中心也優(yōu)于執(zhí)行這些步驟的其他中心。蛋白質組覆蓋率似乎在很大程度上取決于工作流程、科學家以及總體上執(zhí)行實驗的中心。這強調了 LC-MS/MS 樣品制備中良好實踐的重要性，并強調了用戶專業(yè)知識作為另一個有影響力的參數的重要性，正如之前所強調的那樣。
       有幾項研究側重于技術和工具方面，這些方面可以在從不同中心檢索的數據中引入異質性，包括其他高通量技術，例如 RNA 測序和微陣列（盡管不是納米顆粒蛋白冠）。其他研究調查了分析前樣品處理和儲存對血漿蛋白質組學的影響。我們已經在之前的報告中討論了幾項研究。
       數據庫搜索中的某些參數可能會對數據輸出產生中度或顯著影響。我們認為，搜索引擎（軟件）的選擇、使用的序列數據庫、包含幾個變量修改以及分配特定或半特異性搜索可以適度地影響數據輸出，而 FDR 率可能會產生最大的影響。雖然不同的搜索引擎可能會產生略有不同的輸出，但一旦它們經過測試，它們就會定期更新，并且它們的輸出是可信的。包含其他修飾或進行半特異性搜索會增加定量肽的數量（因此，蛋白質的數量），但代價是假陽性發(fā)現率較高。選擇較高的 FDR 臨界值通常會導致鑒定出更多的蛋白質，但與此同時，假陽性命中的數量也會增加。肽水平上較高的 FDR 將允許大量錯誤識別的肽，這可能會在以后損害基于肽水平鑒定的蛋白質水平推斷38。高 FDR 對于由少數肽檢測到的低豐度蛋白質尤其有害。因此，這里我們將主要討論 FDR 控制的重要性。
       一些研究調查了 FDR 控制對不同中心蛋白質組學分析的影響。例如，Collins 等人5 對全球 11 個地點的所有理論碎片離子譜 （SWATH） MS 數據采集進行了順序窗口采集的比較重現性分析。將一組連續(xù)稀釋的標準肽加標到 HEK293 細胞裂解物中。雖然所有站點都使用了 SCIEX TripleTOF 5600/5600+ 質譜儀，但納離子色譜系統(tǒng)具有不同的型號，但來自同一供應商 SCIEX。該研究檢測到一組核心 4,077 種蛋白質，這些蛋白質在 >80% 的樣品中被一致檢測到。與我們研究的結果類似，當數據分析和 FDR 控制在逐個站點的基礎上獨立進行時，注意到站點之間一致檢測到的蛋白質減少。但是，應該注意的是，沒有進行樣品制備，因此工作流程的變化仍然很小。上述示例表明，通過集中樣品制備和數據分析，以及最大限度地減少儀器參數的變化，可以實現復雜樣品中大多數蛋白質的重現性。
      與上述研究相比，相同的蛋白冠樣品被運送到不同的中心，隨后的樣品制備和 LC-MS/MS 分析由中心自行決定進行，沒有要求/提供標準化的儀器參數或方案。因此，當前研究中唯一的匯總步驟是蛋白質樣品的制備、數據提取、處理和分析。此外，我們研究中的中心必須執(zhí)行數據依賴性采集 （DDA）。與 SWATH 不同，DDA 采集涉及隨機碎片離子 （MS2） 采樣，因此肽采樣的可重復性較低; 即，當母離子的數量超過母離子選擇周期的數量時，母離子選擇變?yōu)殡S機。
      人類蛋白質組組織 （HuPO） 測試樣品工作組將 20 種高度純化的重組蛋白的等摩爾混合物分發(fā)給 27 個不同的實驗室，這些實驗室依次根據自己的常規(guī)和方案分析樣品，沒有任何限制。在 27 個實驗室中，只有 7 個實驗室正確報告了所有 20 種蛋白質。對原始數據的集中分析表明，在所有 20 個實驗室中都檢測到了所有 27 種蛋白質。漏診鑒定或假陰性、環(huán)境污染、數據庫匹配問題以及蛋白質鑒定的管理被發(fā)現是異質性的來源。研究表明，在肽鑒定和蛋白質分配中觀察到的主要變異性是由數據處理和分析的差異引起的，而不是由數據收集的差異引起的。
      在這里，我們證明，通過在蛋白質和肽水平上應用嚴格的 FDR 臨界值并統(tǒng)一其他搜索參數，例如酶特異性、可變翻譯后修飾和考慮遺漏切割的肽，與在每個位點進行單獨數據庫搜索相比，一致定量蛋白質的百分比增加了 9 倍。與我們之前的研究相比，由不同的核心機構進行獨立的數據庫搜索，鑒定出 4022 種蛋白質，而我們在這里鑒定了 1429 種蛋白質，僅量化了 717 種蛋白質。
       我們認為，與其他類型的蛋白質組學分析（例如細胞和組織）相比，血漿蛋白質組學通常具有挑戰(zhàn)性，這是蛋白冠層中一致檢測到蛋白質的比率較低的主要原因之一。同樣，在之前的研究中，作者重新分析了 2005-2017 年的 178 項實驗數據，表明只有 50% 的研究報告了 500 種最豐富的血漿蛋白。
       總之，我們揭示了使用統(tǒng)一的數據庫搜索為使用 LC-MS/MS 在蛋白冠研究中采取措施和質量控制提供了機會。這種方法為協(xié)調蛋白冠結果的數據分析鋪平了道路，使利益相關者能夠對現有文獻中的蛋白質組學數據進行薈萃分析。它旨在最大限度地減少由于不同實驗室的樣品制備和工作流程差異而引起的沖突和差異。提高蛋白冠研究中的可重復性和蛋白質組覆蓋率可以加速納米醫(yī)學技術在診斷和治療應用中的成功臨床轉化。

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