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基本實(shí)驗(yàn)步驟

（1）收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g離心30 min后取上清；

（2） 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1μg相應(yīng)的抗體和10-50 μl protein A/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；

（3）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 g速度離心5 min,將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加樣緩沖液，沸水煮10分鐘；

（4）SDS-PAGE, Western blotting或進(jìn)行質(zhì)譜分析。

一、 樣品處理：

      免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否，第一步處理樣品非常關(guān)鍵。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)本質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。所以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功非常關(guān)鍵。在這個(gè)環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4°完成外，最為關(guān)鍵的是裂解液的成份。

      用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的樣品一般是原代培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或者細(xì)胞系裂解液。我們以常用的RIPA裂解液為例（主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃度下的NaCl,一定比例的去垢劑和甘油以及各類(lèi)蛋白酶抑制劑等）來(lái)說(shuō)明其各主要成份的用途，進(jìn)而幫助我們?nèi)绾吾槍?duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌牡鞍踪|(zhì)特性來(lái)選擇最佳的裂解液。

      a. 緩沖液：離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

      b. NaCl濃度一般習(xí)慣用150 mM,這主要是因?yàn)?50 mM接近生理濃度，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而細(xì)胞內(nèi)部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能會(huì)破壞這個(gè)區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細(xì)胞定位而定。

      c. 甘油由于其粘性，可以對(duì)蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個(gè)很好的保護(hù)作用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。

      d. 裂解液中的去垢劑可以裂解細(xì)胞質(zhì)膜，也同時(shí)破壞了許多細(xì)胞器的膜，從而釋放了其中儲(chǔ)存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來(lái)自胞質(zhì)中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復(fù)了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對(duì)于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。一般主要通過(guò)添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過(guò)Protease Cocktail（多種蛋白酶抑制劑混合物）可以抑制蛋白酶。

      e. 去垢劑對(duì)于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)尤其是免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。不同的去垢劑種類(lèi)和不同的去垢劑濃度主要通過(guò)影響以下三個(gè)因素來(lái)影響免疫沉淀效果：

      - 細(xì)胞質(zhì)/器膜的通透性：因?yàn)樵S多目的蛋白都定位在細(xì)胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來(lái)，抗體才能與之反應(yīng)。

      - 膜蛋白的釋放：許多膜蛋白的構(gòu)象對(duì)去垢劑種類(lèi)和濃度非常敏感，因此針對(duì)這類(lèi)蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，需要謹(jǐn)慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。

      - 蛋白相互作用：不同去垢劑對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進(jìn)行分析選擇去垢劑種類(lèi)和濃度。而由于何種去垢劑適應(yīng)作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，所以一個(gè)更為切實(shí)可行的辦法就是通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)篩選合適的去垢劑種類(lèi)和濃度。

二、 抗體-agarose beads孵育

       裂解細(xì)胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲(chǔ)存在-80°保存3個(gè)月，但最好能夠使用新鮮制備的細(xì)胞裂解液上清去進(jìn)行抗體-agarose beads孵育實(shí)驗(yàn)。抗體可以先加入上清中與樣品孵育數(shù)小時(shí)后再加入Protein A或者G beads孵育過(guò)夜，也可以同時(shí)加入抗體和Protein A或者G beads孵育過(guò)夜。一般選擇1mg總蛋白（1mg/ml）對(duì)應(yīng)添加1 ug抗體，最高可以添加至5 ug抗體，過(guò)多的抗體會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。這個(gè)步驟中關(guān)鍵因素在于選擇合適的陰性對(duì)照。一般選用加同樣量的IgG,但更為妥當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沁x擇針對(duì)胞內(nèi)其它無(wú)關(guān)目的蛋白的一抗做對(duì)照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來(lái)做陰性對(duì)照，只要確認(rèn)二者之間沒(méi)有相互作用；而做胞質(zhì)可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個(gè)可溶性蛋白D來(lái)做陰性對(duì)照。同時(shí)，為避免Protein A或者G beads有（非）特異性吸附從而造成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預(yù)先將Protein A或者G beads與細(xì)胞裂解液孵育數(shù)小時(shí)，然后取上清用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育。

同時(shí)，Protein A或者G beads對(duì)不同類(lèi)型的抗體親和力不同，結(jié)合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的Protein A或者G beads也是決定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否的一個(gè)重要因素。一般推薦使用Protein A和Protein G beads的混合物，這樣可以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)效果，而且省去了許多選擇的煩惱。

三、 抗體-agarose beads復(fù)合物洗滌：

      除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對(duì)照外，去除免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非特異性的一個(gè)辦法是對(duì)抗體-agarose beads復(fù)合物進(jìn)行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來(lái)的非特異性吸附。針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)要求，還可以通過(guò)更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類(lèi)來(lái)達(dá)到去除非特異性吸附的效果。例如，針對(duì)單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者雖然是進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度（0.2-0.5%）的SDS洗滌抗體-agarose beads復(fù)合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。

四、 鑒定

      免疫沉淀實(shí)驗(yàn)用途非常廣泛（見(jiàn)IP: Q&A），而且基于最基本的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)衍生出了許多免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段（比如免疫共沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀），因此，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的鑒定方法主要視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?

      我們?cè)诒臼謨?cè)中主要簡(jiǎn)單概述常見(jiàn)的免疫沉淀之后的WB檢測(cè)需要注意的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。由于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)使用目的蛋白抗體加Protein A/G beads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體-agarose beads復(fù)合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之間是以非共價(jià)健結(jié)合在一起，只有Protein A/G與agarose beads是共價(jià)結(jié)合在一起的。因此，最后經(jīng)過(guò)添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導(dǎo)致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重鏈分子（55KD）和輕鏈分子（25KD）。因此，WB顯色反應(yīng)中除了能檢測(cè)到目的蛋白外，如果所使用的二抗與用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體分子屬于同一種屬的話，還能檢測(cè)到重鏈和輕鏈分子。通常用于免疫沉淀的抗體量非常大（1ug），所以當(dāng)目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時(shí)，重鏈或者輕鏈分子的WB信號(hào)常常由于信號(hào)過(guò)強(qiáng)而導(dǎo)致影響對(duì)目的蛋白的WB結(jié)果判斷。

     針對(duì)上述情況，通常有二種解決辦法：

      a. 選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無(wú)種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號(hào)。

      b. 使用交聯(lián)劑將抗體和Protein A/G beads交聯(lián)，然后通過(guò)添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-agarose beads復(fù)合物，最后離心去除抗體-agarose beads復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白。

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