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       在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域，血液樣本作為蘊(yùn)含豐富疾病信息的微創(chuàng)樣本為疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了寶貴的資源。然而，血漿樣本處理過程中的污染問題始終是懸在研究者頭頂?shù)摹?/span>達(dá)摩克利斯之劍”。近日，德國馬普所的蛋白組學(xué)大神Matthias Mann，和他的知名高足Phillipp Geyer在bioarxiv上發(fā)表一篇題為“Pre-Analytical Drivers of Bias in Bead-Enriched Plasma Proteomics”的研究結(jié)果，劍指在質(zhì)譜血漿蛋白組學(xué)領(lǐng)域一直存在的蛋白鑒定數(shù)據(jù)質(zhì)量良莠不齊、缺乏標(biāo)準(zhǔn)，甚至人為數(shù)據(jù)造假的亂象。

      Matthias Mann大家都很熟悉了，是當(dāng)今國際蛋白組學(xué)的擎旗人。Philipp Geyer是人類血漿蛋白組計(jì)劃（HPPP）的主要負(fù)責(zé)人，也是Ions Lab的創(chuàng)始人，一直致力于將蛋白組學(xué)推向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)化。其實(shí)，早在血漿蛋白質(zhì)組解決方案推出之初便根據(jù)Matthias Mann團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《Embo Molecular Medicine》（IF=9.0）的血漿樣本紅細(xì)胞、血小板、凝血污染質(zhì)控建議設(shè)計(jì)了“血漿質(zhì)量影響因素評(píng)估”模塊，協(xié)助廣大研究者進(jìn)行污染樣本剔除。

1. 納米顆粒表面蛋白冠——檢測(cè)深度與污染敏感性的平衡

       血漿蛋白質(zhì)豐度范圍廣泛，其中22種高豐度蛋白含量占比超過總蛋白含量99%，低豐度蛋白占比少于1%，卻在疾病早期診斷、預(yù)后治療、生物標(biāo)志物研究方面具有重要價(jià)值。為提升血漿蛋白質(zhì)組隊(duì)低豐度蛋白的覆蓋度，業(yè)內(nèi)專家陸續(xù)提出了多種前處理方案。Philipp Emmanuel Geyer/Matthias Mann團(tuán)隊(duì)的最新研究基于常見的五種血漿蛋白質(zhì)組前處理方法，通過在純凈血漿樣本中添加指定數(shù)量的血小板、紅細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），比較各前處理方法對(duì)細(xì)胞污染的抵抗性。研究發(fā)現(xiàn)富集技術(shù)雖能顯著提升低豐度蛋白的檢測(cè)深度，但對(duì)細(xì)胞污染高度敏感。相比之下，PCA-N流程對(duì)細(xì)胞污染表現(xiàn)出較強(qiáng)抵抗力。

        這個(gè)研究的核心精髓體現(xiàn)在下面一張數(shù)據(jù)圖，能給血漿蛋白組學(xué)的健康良性發(fā)展正本清源，筆者覺得有必要拿出來詳細(xì)講解。

       圖A是整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，解釋了如何將一份血液樣本分成：

• 血漿（Plasma）
• 血小板（Platelet）
  
• 外周血細(xì)胞（PBMCs）
• 血細(xì)胞（Erthryocytes，RBC）

       圖B顯示的是在血漿樣本里面摻入不同數(shù)量的血小板、PMBC、和血細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量從0增加到2x10⁶，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究污染程度對(duì)蛋白鑒定量的影響。圖C、圖D、圖E分別展示了不同類型的細(xì)胞污染源（圖C：血小板；圖D：血細(xì)胞；圖E：PMBCs）和污染程度對(duì)血漿樣本蛋白組鑒定量的影響。圖中不同的點(diǎn)線則代表了不同樣本前處理方式下，對(duì)應(yīng)的血漿蛋白檢測(cè)量的變化。即：

• Neat：未經(jīng)任何蛋白富集方法；
• PCA-N：經(jīng)過高氯酸沉淀并中和；
• SAX：經(jīng)過帶正電荷的磁性微球（強(qiáng)陰離子交換法）；
• Sear Sil 700：經(jīng)過帶硅醇羥基基團(tuán)的負(fù)電荷微球；
• Non-magnetic：經(jīng)過非磁性（SiO2）微球富集；

       從圖C、D、E上可以明顯看出來，對(duì)于所有血漿樣本前處理方法，第一：隨著污染源的增加（X軸從右往左），被污染的血漿樣本里面檢測(cè)到的蛋白數(shù)量（Y軸：Protein IDs）顯著增加；第二：在摻雜污染細(xì)胞數(shù)量少于1X10⁴時(shí)，圖上所有樣本前處理方法，僅僅能檢測(cè)到1000~2000種血漿蛋白；圖中的富集法（SAX, Sear Sil 700, SiO2）僅僅比非富集法（Neat, PCA-N）高出數(shù)百個(gè)蛋白；第三：往純血漿樣本中摻雜2X10⁵污染細(xì)胞后，該樣本的蛋白鑒定數(shù)量馬上出現(xiàn)顯著提升。最高可達(dá)6000個(gè)到8000個(gè)蛋白！因此控制污染細(xì)胞數(shù)量少于1X10⁴，對(duì)于血漿蛋白組學(xué)研究是必要的。

2. 三步污染控制策略——通過分析與驗(yàn)證減少污染影響

基于以上結(jié)論，為了系統(tǒng)地評(píng)估和減少污染對(duì)血漿蛋白質(zhì)組分析的影響，該研究提出了一套“三步污染控制策略”：

單樣本污染指數(shù)評(píng)估：使用經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)胞特異性標(biāo)志物面板識(shí)別和量化樣本中不同類型細(xì)胞的污染程度，計(jì)算每個(gè)樣本的污染指數(shù)。

組間污染差異檢測(cè)：比較不同組別之間的污染標(biāo)記物，如果存在顯著差異，則需進(jìn)一步評(píng)估污染標(biāo)志物蛋白與目標(biāo)生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性。

候選標(biāo)志物與細(xì)胞特異性蛋白的相關(guān)性分析：計(jì)算候選生物標(biāo)志物蛋白與細(xì)胞特異性標(biāo)志物蛋白之間的相關(guān)性，對(duì)于相關(guān)候選生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，如使用獨(dú)立隊(duì)列驗(yàn)證。

3. 標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理流程——規(guī)避細(xì)胞污染的關(guān)鍵

       為了最大限度地減少細(xì)胞污染對(duì)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析的影響，文章基于研究結(jié)果，提出了以下標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理流程：

       采血管

       避免在同一研究中使用不同類型的抗凝劑或采血管，防止蛋白質(zhì)組學(xué)模式的不同增加批次效應(yīng)和變異性。建議使用EDTA抗凝劑從而在基于磁珠的富集方法中獲得最高且最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。肝素-Li抗凝劑會(huì)引入不同的蛋白質(zhì)組模式，這可能是由于其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合和凝固的影響。

       離心條件

       推薦3000g離心30min分離血漿，該條件可最大程度減少所有類型采血管采集的血液的所有三種類型細(xì)胞污染，包括血小板、紅細(xì)胞和PBMC。尤其在使用凝膠分離管時(shí)，較低的離心力（例如500g或1000g）下由于凝膠屏障尚未完全形成，會(huì)導(dǎo)致渦流效應(yīng)，從而使細(xì)胞物質(zhì)重新懸浮，增加污染。

從實(shí)用的角度評(píng)估，建議3000g離心至少7min分離血漿，但需參考三步污染控制策略評(píng)估細(xì)胞污染影響。

       凍融

       反復(fù)凍融循環(huán)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和污染標(biāo)記物蛋白的釋放，推薦將樣本分裝成小份并在-80°C條件下儲(chǔ)存。

4. 拿到血漿蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，一定要警惕！

      第一個(gè)警惕：警惕你的血漿樣本是否存在細(xì)胞污染！如何從蛋白組數(shù)據(jù)檢測(cè)是否存在污染？Philipp Geyer在2019年有一篇詳細(xì)的文章，描述了細(xì)胞污染評(píng)估算法，具體內(nèi)容可以參考文獻(xiàn)（Geyer et al, EBMO Mol Med, 2019)。

      第二個(gè)警惕：警惕商家過度宣傳！尤其是遇到公司宣傳能夠通過質(zhì)譜方法從單個(gè)樣本中檢測(cè)6000個(gè)甚至8000個(gè)蛋白，一定要關(guān)注是否有很多血小板、血細(xì)胞、PBMCs的蛋白。要知道，目前基于NGS的蛋白組學(xué)平臺(tái) Olink HT，僅能檢測(cè)3000個(gè)左右血漿蛋白。Somalogic 11K宣傳能檢測(cè)11K個(gè)血漿蛋白，但是其官網(wǎng)顯示其中55%個(gè)蛋白未經(jīng)驗(yàn)證。

     第三個(gè)警惕：不高迷信蛋白檢測(cè)數(shù)量，穩(wěn)定性更重要！蛋白檢測(cè)數(shù)量固然重要，但是蛋白鑒定的穩(wěn)定性更加重要。蛋白檢測(cè)可能存在很多假陽性，可能盡管檢測(cè)到了很多蛋白，但是最終得到的蛋白標(biāo)志物，就是一個(gè)假陽標(biāo)志物。這白白浪費(fèi)了樣本、時(shí)間、精力和錢。

     廈門普睿邁格生物科技有限公司設(shè)計(jì)的多磁珠協(xié)同前處理血液樣本（http://www.5000js.com/Product/8096211554.html），充分發(fā)揮不同磁珠表面特性結(jié)合蛋白的優(yōu)勢(shì)，具有結(jié)果穩(wěn)定的特點(diǎn)。