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       無(wú)獨(dú)有偶，近日，德國(guó)馬普所的蛋白組學(xué)大神Matthias Mann，和他的知名高足Phillipp Geyer在bioarxiv上發(fā)表一篇題為“Pre-Analytical Drivers of Bias in Bead-Enriched Plasma Proteomics”的研究結(jié)果，劍指在質(zhì)譜血漿蛋白組學(xué)領(lǐng)域一直存在的蛋白鑒定數(shù)據(jù)質(zhì)量良莠不齊、缺乏標(biāo)準(zhǔn)，甚至人為數(shù)據(jù)造假的亂象。參考我站評(píng)述文章http://www.5000js.com/html/1086233051.html，與本篇解讀遙相呼應(yīng)。

       研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化納米顆粒富集血漿蛋白質(zhì)的條件，建立了一個(gè)高靈敏度的流程OmniProt，構(gòu)建了覆蓋超過(guò)1萬(wàn)個(gè)血漿蛋白的質(zhì)譜圖庫(kù)，并開(kāi)發(fā)了自動(dòng)化污染識(shí)別軟件Baize，全面提升了血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定深度和實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性與臨床可用性。

圖1 文章截圖

       盡管納米顆粒富集技術(shù)近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于提升質(zhì)譜在血漿中的蛋白鑒定深度，但不同研究之間蛋白鑒定數(shù)量差異顯著（2000至7000個(gè)不等），引發(fā)對(duì)其穩(wěn)定性與可靠性的質(zhì)疑。尤其是血小板、紅細(xì)胞或凝血成分的污染，作為臨床采樣中常見(jiàn)卻易被忽視的問(wèn)題，可能是造成結(jié)果波動(dòng)的重要原因。為此，本研究通過(guò)開(kāi)發(fā)高效的NP富集流程OmniProt、建立大規(guī)模血漿譜庫(kù)，并引入Baize軟件系統(tǒng)性評(píng)估污染影響，全面揭示了污染在血漿蛋白質(zhì)組分析中的干擾機(jī)制，并驗(yàn)證了該策略在肺癌臨床樣本中的可行性與診斷潛力。

圖2 研究流程

01. 納米顆粒的篩選與性能評(píng)估

       研究首先針對(duì)低豐度血漿蛋白的富集需求，系統(tǒng)比較了不同類型的二氧化硅納米顆粒，包括固體球形、介孔、空心介孔及分級(jí)孔結(jié)構(gòu)等類型。

       在肺癌患者血漿樣本的重復(fù)分析中，所有納米顆粒之間鑒定的蛋白質(zhì)重疊度超過(guò)80%，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好（CV為1–2%），表明該納米顆粒富集策略技術(shù)穩(wěn)定性高。結(jié)果顯示，固體二氧化硅納米顆粒在蛋白質(zhì)（protein groups）與肽段（peptides）的鑒定數(shù)量上均優(yōu)于其他類型，分別提高了約16%和33%。

       進(jìn)一步比較不同直徑的固體顆粒（300–1000 nm）后發(fā)現(xiàn)，盡管蛋白鑒定數(shù)目差異不大，但從表面積、離心洗滌效率及操作便捷性等因素綜合考慮，500 nm直徑顆粒（NP23）在性能與實(shí)用性之間達(dá)成了良好平衡，因此被選為后續(xù)工作的最佳納米顆粒材料。

圖3 不同類型的二氧化硅納米顆粒

02. OmniProt血漿蛋白質(zhì)組流程的建立

       在確立NP23為富集載體后，研究?jī)?yōu)化了關(guān)鍵步驟，包括血漿稀釋、蛋白冠形成、洗脫軟冠以及納米顆粒的儲(chǔ)存條件。在稀釋條件對(duì)比中，堿性緩沖液（pH 11）顯著提高了蛋白與肽段的鑒定數(shù)量（分別提升12%與36%），并在掃描電鏡觀察中顯示出穩(wěn)定的納米顆粒結(jié)構(gòu)與蛋白冠形成。在優(yōu)化顆粒用量和孵育時(shí)間的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)使用0.5 mg納米顆粒、30分鐘孵育為最佳條件。三輪洗滌及7000 g離心條件被證明是有效去除軟蛋白冠的方式。此外，短期在4–30°C范圍內(nèi)儲(chǔ)存不影響其蛋白富集性能，表明該系統(tǒng)具備較好的溫度穩(wěn)定性。這些系統(tǒng)性的優(yōu)化奠定了OmniProt流程的標(biāo)準(zhǔn)化基礎(chǔ)，確保了其在血漿蛋白質(zhì)組學(xué)中的穩(wěn)定性與重復(fù)性。

03. 構(gòu)建10,000+蛋白質(zhì)組的血漿譜圖庫(kù)

      為支持后續(xù)數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）分析，研究團(tuán)隊(duì)利用21種化學(xué)特性不同的納米顆粒對(duì)20位肺癌患者的血漿樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)富集，并通過(guò)高pH反相色譜將肽段分為30或60個(gè)組分，進(jìn)而進(jìn)行Astral nDIA分析，總計(jì)生成780個(gè)DIA數(shù)據(jù)文件。

       通過(guò)DIA-NN分析，最終建立了包含126,661個(gè)肽段離子、對(duì)應(yīng)10,109個(gè)蛋白組的高覆蓋度譜庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋了人類血漿蛋白質(zhì)圖譜中94%的已知蛋白，并顯示出對(duì)多種NP特性（如電荷、官能團(tuán)、親水/疏水性）的響應(yīng)差異。廈門普睿邁格提供各種不同特性的磁珠（http://www.5000js.com/Product/MSpretreatment/），可用于評(píng)估其在血液樣本中的蛋白冠形成情況。

       功能富集分析表明，這些蛋白涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、蛋白磷酸化、細(xì)胞粘附及先天免疫等多個(gè)生物過(guò)程，同時(shí)揭示了該資源對(duì)神經(jīng)退行性疾病、代謝通路及腫瘤通路的顯著覆蓋能力，體現(xiàn)其廣泛的應(yīng)用潛力。

利用21種化學(xué)特性不同的納米顆粒對(duì)20位肺癌患者的血漿樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)富集

04. OmniProt對(duì)低豐度蛋白的檢測(cè)性能評(píng)估

       研究將OmniProt與商用Top14高豐度蛋白去除試劑盒及傳統(tǒng)直接酶解（Neat）方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，OmniProt在蛋白組與肽段鑒定數(shù)量上分別比Top14高1.7倍和2.6倍，比Neat方法高4.8倍和5.7倍，顯著提升了低豐度蛋白的檢測(cè)能力。尤其在log10強(qiáng)度為3.2–4.5的區(qū)間內(nèi)，OmniProt能檢測(cè)更多低豐度蛋白。此外，在人-?；旌蠘颖镜慕徊嫖锓N定量精度測(cè)試中，OmniProt在檢測(cè)蛋白數(shù)量與定量準(zhǔn)確性方面均優(yōu)于直接分析組，且生物學(xué)重復(fù)之間的變異系數(shù)中位數(shù)低于20%，證實(shí)了該流程的高靈敏度與高重復(fù)性，適用于復(fù)雜背景中的精準(zhǔn)蛋白定量分析。

圖5 OmniProt的定性和定量評(píng)估

05. 不同血漿樣本中蛋白鑒定數(shù)量的變異性

       在對(duì)OmniProt流程優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，在不同的血漿樣本應(yīng)用中觀察到顯著的蛋白鑒定數(shù)量差異，范圍從約3000至7000個(gè)蛋白組不等。

       進(jìn)一步分析表明，蛋白鑒定數(shù)目較高的樣本中存在大量血小板或紅細(xì)胞來(lái)源的蛋白，提示樣本可能受到這些細(xì)胞成分的污染。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了研究團(tuán)隊(duì)對(duì)血液污染對(duì)蛋白質(zhì)組分析干擾機(jī)制的深入探討，并為后續(xù)污染標(biāo)志物的鑒定與評(píng)估工具的開(kāi)發(fā)提供了研究動(dòng)因。

06. 血小板污染及其標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)

       為了系統(tǒng)評(píng)估血小板污染對(duì)NP富集流程的影響，研究構(gòu)建了PRP（富血小板血漿）與PPP（貧血小板血漿）的混合梯度樣本，并使用Neat和OmniProt流程進(jìn)行處理。

        結(jié)果表明，血小板污染顯著增加蛋白鑒定數(shù)量，同時(shí)干擾低豐度循環(huán)蛋白的定量準(zhǔn)確性。現(xiàn)有文獻(xiàn)的30個(gè)血小板污染標(biāo)志物在OmniProt處理下表現(xiàn)相關(guān)性降低，提示需建立適用于基于納米顆粒流程的新標(biāo)志物集。通過(guò)Mfuzz聚類與相關(guān)性分析，篩選出30個(gè)與血小板污染程度高度相關(guān)的新標(biāo)志物（Spearman r > 0.92），涵蓋血小板功能相關(guān)蛋白，并通過(guò)12例患者樣本驗(yàn)證。

        研究還開(kāi)發(fā)了Baize軟件，通過(guò)這些標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)污染程度評(píng)估（R2 = 0.95）。此外，在不同納米材料處理下，該標(biāo)志物集表現(xiàn)穩(wěn)定，具備跨平臺(tái)適用性，但污染指數(shù)的評(píng)估不可在跨納米材料直接比較。

07. 紅細(xì)胞污染及其標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)

       為研究紅細(xì)胞污染對(duì)NP蛋白質(zhì)組的影響，研究人員設(shè)計(jì)了紅細(xì)胞-PPP混合梯度模型。紅細(xì)胞污染同樣導(dǎo)致蛋白識(shí)別數(shù)量增加，并干擾紅細(xì)胞無(wú)關(guān)蛋白的定量。研究從高相關(guān)性（r>0.98）蛋白中篩選出30個(gè)與紅細(xì)胞污染相關(guān)的新標(biāo)志物，涵蓋血紅蛋白、細(xì)胞膜骨架及氣體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有明確生物學(xué)特異性。通過(guò)六例患者的稀釋梯度實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，并開(kāi)發(fā)紅細(xì)胞污染指數(shù)，集成入Baize軟件，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量（R2=0.94）。

08. 凝血相關(guān)的污染及其標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

       研究指出，血漿樣本在采集過(guò)程中如操作不當(dāng)，易因凝血不全而形成血漿-血清混合狀態(tài)，影響蛋白質(zhì)組學(xué)的定量結(jié)果。

       為評(píng)估抗凝劑的影響，研究人員比較了使用三種不同抗凝管（EDTA、檸檬酸鈉、肝素）采集的樣本，經(jīng)Neat與OmniProt處理后的質(zhì)譜結(jié)果。蛋白識(shí)別總量無(wú)明顯差異，但僅59.2%的蛋白在三種抗凝劑中同時(shí)被檢測(cè)到，說(shuō)明不同類型的采血管對(duì)蛋白譜具有影響。功能分析顯示，OmniProt在B細(xì)胞發(fā)育、翻譯起始、免疫及病毒復(fù)制相關(guān)蛋白上有更強(qiáng)富集。

       隨后研究比較了血漿樣本（紫頭管）與血清樣本（紅頭管），經(jīng)OmniProt處理后，血漿和血清中蛋白識(shí)別數(shù)量均顯著高于Neat方法（3041 vs 816；3066 vs 796）。通過(guò)篩選上下調(diào)顯著（fold change ≥ 5，p < 0.05）的蛋白，確定了20個(gè)與凝血相關(guān)的污染標(biāo)志物（如FGA、FGG、FGB、AGGF1、TFRC），并將其整合為凝血污染評(píng)估模型，引入Baize軟件。

09. Baize軟件：NP血漿污染評(píng)估工具

       研究人員開(kāi)發(fā)了名為 Baize的網(wǎng)頁(yè)工具，用于快速評(píng)估NP富集血漿樣本中的三類關(guān)鍵污染：血小板、紅細(xì)胞和凝血相關(guān)污染。

       軟件通過(guò)計(jì)算每類污染標(biāo)志物信號(hào)強(qiáng)度與總蛋白信號(hào)之比，生成污染指數(shù)（Contamination Index）。用戶上傳蛋白表達(dá)矩陣后，Baize可自動(dòng)輸出各樣本的污染狀態(tài)。該工具免費(fèi)開(kāi)放，地址為：https://www.guomics.com/Baize

10. OmniProt和Baize在肺癌臨床隊(duì)列中的應(yīng)用

       為驗(yàn)證OmniProt和Baize的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，研究分析了199例肺結(jié)節(jié)患者（含良性、早期惡性及6例晚期對(duì)照）的血漿樣本。樣本采用OmniProt流程處理后進(jìn)行Astral 質(zhì)譜儀的nDIA方法采集數(shù)據(jù)，平均每例鑒定出約4413個(gè)蛋白組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高。通過(guò)Baize檢測(cè)出5例存在明顯污染，已從后續(xù)分析中剔除。

       隨后，研究人員采用8種機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)良惡性結(jié)節(jié)進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)Extra Trees模型在F1分?jǐn)?shù)、準(zhǔn)確率、召回率及AUC方面表現(xiàn)最優(yōu)。

       模型最終篩選出與肺癌相關(guān)的關(guān)鍵蛋白如FSCN1、PDGF、FCGR3A、HAMP、COL15A1等，表明該蛋白組數(shù)據(jù)具備區(qū)分肺癌病理狀態(tài)的潛力，盡管進(jìn)一步驗(yàn)證仍需獨(dú)立隊(duì)列支持。

圖7 OmniProt在肺癌臨床隊(duì)列中的應(yīng)用

       研究首次系統(tǒng)闡明了血液污染對(duì)基于納米顆粒富集血漿蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的廣泛影響，提供了技術(shù)流程（OmniProt）、計(jì)算工具（Baize）與數(shù)據(jù)資源（譜庫(kù)）三位一體的解決方案，為血漿蛋白質(zhì)組的高通量精準(zhǔn)測(cè)定及其在臨床疾病生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。