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主流分子診斷技術(shù)全解析

2019-11-26 22:37:20點擊:



截止2019年3月,分子診斷產(chǎn)品獲批數(shù)量達(dá)1197項。按照技術(shù)原理,可以將上市分子診斷技術(shù)大致劃分為PCR技術(shù)、分子雜交、基因測序、核酸質(zhì)譜、生物芯片5大類。
未來3-5年IVD行業(yè)最具發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)品線是什么?
答案無疑是分子診斷。狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)。

隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展,分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從DNA/RNA拷貝、突變等檢測,拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測。

從目前市場分子診斷產(chǎn)品來看,基于核酸診斷技術(shù)的產(chǎn)品仍占主要。

廈門普睿邁格(http://www.5000js.com)提供成熟的生物磁珠技術(shù)、服務(wù)和產(chǎn)品。


分子診斷技術(shù)體系

1. PCR技術(shù)


從各類技術(shù)類別來看,PCR技術(shù)由于壁壘相對較低,國產(chǎn)化程度高,國內(nèi)企業(yè)布局相對較早,因此基于PCR技術(shù)的分子診斷產(chǎn)品占總產(chǎn)品量的70%以上。

PCR技術(shù)是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),基本原理是在反應(yīng)室中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制,即人為創(chuàng)造核酸半保留復(fù)制條件,使目的DNA在細(xì)胞外完成擴(kuò)增的過程。通過PCR技術(shù)進(jìn)行分子診斷的流程如下:核酸提取——核酸擴(kuò)增——核酸檢測。

按照靶標(biāo)數(shù)量劃分,PCR技術(shù)平臺通常可分為qPCR和ddPCR。


1.1 實時熒光定量PCR(qPCR)

Real-time PCR,美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù),該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實現(xiàn)其定量功能的,與普通PCR相比,實時定量PCR具有許多優(yōu)點:利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最終對起始模板的定量分析。


1.2 ddPCR(數(shù)字PCR)
ddPCR系統(tǒng)利用油包水技術(shù),在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前將一個大的反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理,將此反應(yīng)體系分割為成千上萬個微滴,即成千上萬個獨立的PCR反應(yīng)體系。在此過程中,樣品被稀釋至單分子水平,并被平均分配到這幾萬個反應(yīng)體系中,每個微滴中不含或者含有至少一個待檢測的核酸靶分子,這樣也相當(dāng)于變相的對靶基因進(jìn)行富集。

目前,國內(nèi)市場已現(xiàn)10余家數(shù)字PCR儀廠商,其中領(lǐng)航基因自主研發(fā)的數(shù)字PCR系統(tǒng)已獲NMPA認(rèn)證,銳訊生物、新羿生物、STILLA、伯樂還在申報中。


2. 核酸測序

經(jīng)典的Sanger測序技術(shù),被稱作是測序?qū)媒饦?biāo)準(zhǔn)。隨著高通量測序技術(shù)應(yīng)用拓展,基因測序技術(shù)將不斷升級,也將進(jìn)一步提高占比,成為未來腫瘤檢測的主要技術(shù)。目前測序市場主流為NGS測序平臺。

2.1 NGS(下一代測序,也被稱為“二代測序”)

二代測序(NGS)在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用快速增漲,其在臨床上的應(yīng)用主要包括疾病目標(biāo)基因集測序(disease-targeted gene panels)、全外顯子組測序(whole exome sequencing , WES)和全基因組測序(whole genome sequencing , WGS)。總體來說,NGS技術(shù)具有通量大、時間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點,可以在短時間內(nèi)對感興趣的基因進(jìn)行精確定位。

在二代測序領(lǐng)域,筆者知道的測序平臺就達(dá)三十多個,Illumina毫無疑問是行業(yè)巨頭,其市場規(guī)模甚至達(dá)到壟斷地步。目前已獲中國國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械批準(zhǔn)的基因測序儀包括:Illumina MiSeq?Dx;華大智造BGISEQ-100、BGISEQ-1000、BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000、MGISEQ-200共6款基因測序儀。

2.2 單細(xì)胞測序

第三代測序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標(biāo)的邊合成邊測序,單分子測序平臺給測序技術(shù)帶來新思路,部分已經(jīng)開始商業(yè)化推廣,但尚未達(dá)到NGS的規(guī)模。

相比二代測序,第三代測序技術(shù)在臨床上的應(yīng)用有明顯優(yōu)勢:第三代測序技術(shù)不需要PCR擴(kuò)增,可直接對單個分子進(jìn)行測序;樣品制備簡單,測序成本進(jìn)一步降低;可直接讀取RNA的序列和包括甲基化在內(nèi)的DNA修飾。這些優(yōu)勢可以大大改善臨床基因測序的成本、速度和質(zhì)量,但單分子測序有通量限制,所以并不適合獨立做全基因組測序,更適于針對有限的、個性化的、目標(biāo)性的應(yīng)用。

幾家重要的單分子測序平臺一覽:

Helicos BioSciences:第一臺真正的單分子測序儀

Pacific Biosciences(PacBio):首個單分子實時測序系統(tǒng)

Oxford Nanopore Technologies:納米孔測序、迷你測序儀


3. 分子雜交

核酸分子雜交技術(shù)是利用DNA 變性與復(fù)性的原理,把不同的DNA 單鏈分子或者DNA 與RNA 的混合物放在同一溶液中,在某種理化因素作用下DNA 雙鏈分子解鏈變性,這樣互補(bǔ)序列的DNA 之間或DNA 與RNA 之間形成雜化的雙鏈。

核酸分子雜交技術(shù)可分為Southern 雜交——DNA和DNA分子之間的雜交;Northern雜交——DNA和RNA分子之間的雜交。

蛋白雜交,也叫Western 雜交,蛋白質(zhì)分子雜交是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法,即蛋白質(zhì)分子(抗原—抗體)之間的雜交。

4. 核酸質(zhì)譜

目前核酸分析所使用的質(zhì)譜電離技術(shù)主要還是采用 ESI 和MALDI。 簡單來講,兩種電離技術(shù)都是軟電離,ESI 檢測的特點是生物大分子帶多個電荷,質(zhì)荷比范圍基本在2000 Da 以下區(qū)間,從而能檢測幾萬乃至更大的生物分子;而MALDI 常得到單電荷峰,與飛行時間(TOF)分析器搭配,檢測范圍可以到幾十萬道爾頓。

質(zhì)譜技術(shù)相比于其他檢測技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、高通量等優(yōu)點,近年來在核酸的高級結(jié)構(gòu)鑒定、寡核苷酸與小分子的相互作用、DNA 損傷與修飾等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

由于生物樣品的復(fù)雜性,質(zhì)譜技術(shù)還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難。但生物質(zhì)譜技術(shù)是科學(xué)研究的有力工具,隨著臨床實驗室對質(zhì)譜的了解和應(yīng)用不斷的加深,未來該檢測平臺或可成為規(guī)范實驗室不可或缺的標(biāo)準(zhǔn)裝備。

5. 生物芯片

5.1 微陣列芯片

也就是常說的基因芯片,又稱DNA微陣列(DNA micro-array)、SNP芯片,是把大量已知序列探針集成在同一個基片(如玻片、膜)上,經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交,通過檢測雜交信號,對生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析。

與傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)相比具有更高的分辨率,可識別Kb級別以上的染色體細(xì)微失衡?;蛐酒壳耙殉蔀閲鴥?nèi)外臨床遺傳學(xué)診斷的一項常規(guī)的技術(shù),在遺傳病檢測、疾病篩查、疾病分型、病原體檢測、個性化用藥等方面均呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

全球知名的芯片公司有 Illumina、Affymetrix(于2016年被賽默飛收購)、安捷倫等。

5.2 微流控芯片

微流控芯片( microfluidic chip) 由微米級流體的管道、反應(yīng)器等元件構(gòu)成,與宏觀尺寸的分析裝置相比,其結(jié)構(gòu)極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比,以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應(yīng)、毛細(xì)效應(yīng)、快速熱傳導(dǎo)和擴(kuò)散效應(yīng)在內(nèi)的特殊性能,從而在一張芯片上完成樣品進(jìn)樣、預(yù)處理、分子生物學(xué)反應(yīng)、檢測等系列實驗過程。

目前使用微流控芯片進(jìn)行指導(dǎo)用藥的多基因位點平行檢測是主要臨床應(yīng)用領(lǐng)域。

分子診斷的高速發(fā)展離不開分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的進(jìn)步。

在過去的50 年中分子診斷技術(shù)取得了三大轉(zhuǎn)化與3項提升:報告信號檢測從放射核素標(biāo)記向熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化、操作方法由手工操作向全自動化轉(zhuǎn)化、檢測分析通量從單一標(biāo)志物向高通量多組學(xué)聯(lián)合判斷轉(zhuǎn)化。

不僅如此,儀器檢測靈敏度、精密度、特異性的也有快速提升。隨著分子診斷技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,分子診斷將會出現(xiàn)理念的革命性進(jìn)步,高通量技術(shù)將更多的進(jìn)入臨床的實際應(yīng)用中。具體如何發(fā)展,我們拭目以待。
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