凝膠色譜填料發(fā)展簡史 – 背后的產(chǎn)業(yè)發(fā)展啟示
2025-5-17 11:16:24點擊：
最近在梳理色譜填料知識庫，特別是凝膠填料的部分，捎帶深入了解了下其發(fā)展歷史。一直好奇這個領域的產(chǎn)品為什么是瑞典人做的比較好，背后的原因是什么？好了，索性一桿子戳到底，這次把它徹底弄個明白，以史為鑒，為將來技術和產(chǎn)品的開發(fā)做一些指導。
寫科技史、產(chǎn)品史和公司史需要結合不同的歷史背景、人物和時間線來組合，缺一不可。本著說清楚，搞明白的精神，我們帶著幾個問題來的，結合問題來找答案（內(nèi)容都是有出處的），根據(jù)答案結合筆者的認知和理解找啟示。
1.天降奇才
回答這個問題，需要把目光投回到1926年，這年的諾貝爾化學獎頒給了瑞典人-Theodor Svedberg (特奧多爾·斯韋德貝里)，作為瑞典人要拿諾貝爾獎，個人認為其實潛在比其他國家要難些，主要是為了體現(xiàn)權威性和公平公正，你頒獎給自己國家的人其實會有些顧慮，得服眾。這位可是個傳奇人物，富二代，少年不學無術，結果有一天被中學校長一頓臭罵，忽然開竅，從此開掛，發(fā)奮讀書，1904年優(yōu)異成績進烏普薩拉大學，1905年就獲學士學位，1907年就獲得博士學位，開始留校當講師。（注： 烏普薩拉：Uppsala,瑞典城市，位于首都斯德哥爾摩北邊不遠，有著名的烏普薩拉大學，同時也是目前全球最重要的色譜凝膠填料供應商Cytiva（思拓凡）的生產(chǎn)基地，前身為GE Healthcare, 再前為Amersham Bioscience，再再前為Pharmacia）
那時候物理化學研究得一個熱點是膠體化學，他為了更好研究膠體，于1924年研制了超速離心機(Ultracentrifuge)， 這東西在當時對于大分子和膠體可以說是打開了局面，起到了很大的推動作用，人們可以用這種離心機來分離純化各種大分子和膠體了。所以1926年就拿了諾貝爾獎。
特奧多爾·斯韋德貝里 The (Theodor) Svedberg - 獲獎者 | 諾貝爾獎訊
Theodor Svedberg (特奧多爾·斯韋德貝里)1926年諾貝爾化學獎獲得者。
好了，故事有了開始，天降牛人，落戶烏普薩拉大學。可是，這只是關于膠體和大分子的分離，跟色譜凝膠有啥關系，別急，第二位大神馬上閃亮登場。
Theodor Svedberg教授拿了諾獎，這下就吸引瑞典各方優(yōu)秀學子來從師優(yōu)勢資源匯集。 1925年，一位來自瑞典港口城市哥德堡的青年學子Arne Tiselius（阿爾內(nèi)·蒂塞利烏斯）開始跟著Svedberg教授讀博士。那么就讓這位年輕人研究研究帶電的膠體顆粒吧，沒想到這位就真在這個方向開拓出了一個新的領域，創(chuàng)立了電泳技術，成為開山鼻祖。所謂電泳，就是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，那么就可以利用帶電粒子在電場中的移動速度不同，使物質分離，這就是電泳技術。他還利用根據(jù)這個原理設計制造的移動界面電泳儀成功分離了三種血清白蛋白，從而可以深入研究其復雜性質，從而使人們對血清蛋白的認知有了巨大進步。1930年拿到博士學位，1938年拿到烏普薩拉大學教授位置，同時在物理化學系外，創(chuàng)建了生物化學系。1948年，Arne Tiselius因對電泳現(xiàn)象和吸附分析的研究，特別是對血清蛋白復雜性質的研究而獲得諾貝爾化學獎。
好，到這里慢慢接近了，電泳和色譜都屬于分離科學的范疇了。
Black and white photo of Arne Tiselius
Arne Tiselius（阿爾內(nèi)·蒂塞利烏斯）1948年諾貝爾化學獎獲得者
好了，到這里，故事的發(fā)展基本上是兩個大牛打基礎的節(jié)奏，Svedberg和Tiselius共同在烏普薩拉大學營造了獨特的學術環(huán)境，后來被稱為"烏普薩拉分離科學學派" （Uppsala School in Separation Science），吸引了無數(shù)富有創(chuàng)新精神的年輕科學家前來朝圣。2. 意外的發(fā)現(xiàn)– 天時、地利、人和
1939年 二戰(zhàn)爆發(fā)，瑞典在整個二戰(zhàn)期間保持中立，但整個世界都在打戰(zhàn)，物資匱乏，得想辦法搞資源啊。瑞典人民喜歡往主食面包加上果醬，一開戰(zhàn)，這個東西就匱乏了。于是瑞典糖業(yè)公司（Sockerbolaget）就找到了烏普薩拉大學的Tiselius教授，您這不是搞生物化學的大牛嗎，咱們這里甜菜很多，能榨出蔗糖來，能不能從里面再搞點別的東西出來，比如果膠替代品（戰(zhàn)爭期間柑橘果膠短缺）。
甜菜
好，這里第三位重磅人物Bj?rn Ingelman（比約恩·英格爾曼）閃亮登場。
Bj?rn Ingelman（比約恩·英格爾曼）
1941年，23歲的Ingelman慕名加入了Tiselius教授的團隊，成為研究助手。接到的任務就是從甜菜中提取果膠以替代戰(zhàn)時短缺的柑橘果膠。無巧不成書，夏天的時候，瑞典糖業(yè)公司給Ingelman寄來很多甜菜樣本，他發(fā)現(xiàn)這些甜菜老是黏黏的，而且提取的果膠質量總是不達標。所以說科學發(fā)現(xiàn)就是那么巧，進一步研究發(fā)現(xiàn)，樣本是因為細菌污染形成黏性物質。 再進一步研究發(fā)現(xiàn)，確定其為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）代謝蔗糖產(chǎn)生的葡聚糖(Dextran)這種高分子量葡萄糖聚合物并非原研究目標，但Ingelman敏銳地意識到其潛在價值。這時候正值二戰(zhàn)熱火朝天的時候，血漿奇缺，這種天然高分子量的親水性物質剛好可以用來替代血漿中的蛋白來保持滲透壓。 于是Ingelman與生理學家Anders Gr?nwall合作，通過動物實驗（如兔子注射）發(fā)現(xiàn)葡聚糖不會引發(fā)抗體反應，且具有與血漿相似的生理特性。所以說有敏銳商業(yè)頭腦的科學家是科技型企業(yè)成功的關鍵，這一偶然發(fā)現(xiàn)似乎與凝膠填料技術相距甚遠，卻成為其誕生的物質基礎。
想法有了，那么接下來怎么生產(chǎn)和推廣呢，畢竟這邊只是個大學的研發(fā)機構，真正的商業(yè)化還需要專業(yè)的才行。這時候關鍵的公司Pharmacia（法瑪西亞）出場了。
Pharmacia公司的歷史可以追溯到1911年，由藥劑師Gustav Felix Gr?nstedt在瑞典斯德哥爾摩創(chuàng)立，和大多數(shù)歐美大藥企的發(fā)家史類似，早期主要是靠賣“神藥”起家的。Pharmacia的起家產(chǎn)品是Phospho-Energon，類似瑞典的神奇藥物“腦白金”， 作為神經(jīng)營養(yǎng)素和治療疲勞和神經(jīng)衰弱的靈丹妙藥銷售。該藥物主要由小牛腦、糖和牛奶制成，以粉末和片劑形式出售。Phospho-Energon多年來一直是其最賺錢的產(chǎn)品，好的地方就是出售的利潤使該公司后來能夠投資原創(chuàng)藥物。
1920-1950的Pharmacia工廠
Pharmacia早期產(chǎn)品Phospho-Energon
幸運的是，1943年 Bj?rn Ingelman 和 Anders Gr?nwall 聯(lián)系了Pharmacia的時候，工程師背景出生的時任總經(jīng)理Elis G?th對這個想法非常感興趣，予以大力支持。四年后，Pharmacia 根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)推出了 Macrodex （6%葡聚糖溶液）產(chǎn)品。這也是 Pharmacia 與烏普薩拉大學生物化學系之間長期合作的開始。這款藥物也被視為瑞典的第一款生物技術藥物。
Elis G?th
Macrodex的西班牙語宣傳頁
嘗到和大學合作的甜頭，Pharmacia公司一發(fā)不可收拾，Elis G?th做了一個非常大膽的決定，在1950年把整個公司搬到了烏普薩拉大學旁邊，同時把剛拿到博士學位的Bj?rn Ingelman招入公司當研發(fā)總監(jiān)，全面負責葡聚糖系列產(chǎn)品的開發(fā)。學術與產(chǎn)業(yè)的這種無縫銜接在當時的歐洲并不多見，卻是瑞典科學界的特色——科學家不滿足于發(fā)表論文，而是積極尋求解決實際問題的途徑；企業(yè)也不短視于眼前利益，愿意投資基礎研究的長期發(fā)展。3.又一次的意外
前面說過瑞典糖業(yè)公司要的是果膠，所以Ingelman在意外發(fā)現(xiàn)葡聚糖（dextran）。為了提高dextran的成膠性，采用環(huán)氧氯丙烷進行交聯(lián)，得到了一種不溶于水，但在水中溶脹的凝膠。但瑞典糖業(yè)公司對這種水不溶性凝膠不是特別感興趣，因此Ingelma沒有申請專利，但他多留個心眼，也沒有公開發(fā)表相關的內(nèi)容。把這種交聯(lián)過的凝膠一直保留著。
接下來的重要人物， Ingelman的兩位師弟Jerker Porath和Per Flodin要登場了。 Porath和Flodin于1950年代初加入Tiselius教授的研究團隊，這兩個年青人被安排從事利用填充柱電泳分離生物大分子，兩人迅速成為好友，時常一起探討科學問題。一起尋找合適的可以用來裝柱進行分離的吸附劑(adsorbent)。 最初嘗試用淀粉和纖維素等材料填充色譜柱，但由于吸附作用較大，效果不佳。
Flodin進到Pharmacia后做的一項研究工作，就是重復再現(xiàn)和確認前面提到的Ingelman用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)葡聚糖的工作，由于有之前淀粉和纖維素等材料填充色譜柱進行分離的經(jīng)驗，F(xiàn)lodin馬上意識到這東西值得一試。由于他和Porath還保持聯(lián)系，經(jīng)常討論科學問題，而此時Porath仍在苦苦尋找合適的適合用于電泳柱分離的惰性（吸附作用小）的填充劑，兩人一拍即合，再次合作。由于葡聚糖的吸附作用非常小，Porath在填充交聯(lián)葡聚糖的色譜柱實驗中，發(fā)現(xiàn)分子按大小分離的現(xiàn)象——大分子比小分子更快通過色譜柱，且無需電場（不同于電泳）。實驗證實該凝膠能高效分離蛋白質，而且葡聚糖凝膠還可以實現(xiàn)對孔徑的控制。兩人立刻意識到這個發(fā)現(xiàn)的重要性，于是一頭Porath在大學實驗室里繼續(xù)做各種實驗進一步驗證，而另一頭，F(xiàn)lodin在1957年在Pharmacia內(nèi)部提交了開發(fā)葡聚糖凝膠用于生物分子分離的項目申請，雖然和Pharmacia做藥物開發(fā)的主業(yè)不符合，但研發(fā)總監(jiān)Bj?rn Ingelman慧眼識珠，力排眾議，大力支持。于是項目立項，有錢有人了，Pharmacia公司這邊負責凝膠的制備，而烏普薩拉大學那邊負責蛋白質和肽的分離實驗，實驗進展順利，1958年申請了兩個專利，一個關于凝膠制備，一個關于關于凝膠過濾。Porath和Flodin將這一方法命名為“凝膠過濾”（Gel Filtration），也就是現(xiàn)在的尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography, SEC）。 Pharmacia也準備好了正式推出交聯(lián)的葡聚糖產(chǎn)品，名字就是現(xiàn)在還在銷售的Sephadex 分別取了Separation, Pharmacia, Dextran這三個單詞的開頭字母, 后續(xù)的一系列產(chǎn)品線命名基本都遵循這個原則。
1959年：Porath和Flodin在《Nature》發(fā)表開創(chuàng)性論文《Gel filtration: A method for desalting and group separation》，描述葡聚糖色譜凝膠填料快速、簡單的分離特性。 同時，Pharmacia公司也在文章發(fā)表的同時，在北美市場正式推出了Sephadex產(chǎn)品，大受歡迎，上市的備貨兩周就被搶空，因為產(chǎn)品太搶手，整個第一年的產(chǎn)品都是直接空運去美國。層析凝膠填料橫空出世，分離科學再次有了重大突破性進展。
Sephadex填料是如何誕生的？
早期Sephadex產(chǎn)品
從Sephadex層析凝膠填料誕生的歷史回顧，我們可以發(fā)現(xiàn)幾個關鍵的節(jié)點，人物，事件以及背后的邏輯關聯(lián)。
1. 天降大牛需珍惜
基因的突變每個人都有，突變的方向和結果，是拼概率事件，這樣才能最大化保持種群的多樣性，提高極端情況下的生存概率。在穩(wěn)定發(fā)展環(huán)境中要出個天才的概率是低的，所以要特別珍惜。像本文中一開始奠定基礎的Theodor Svedberg正是一個極好的例子，天才和大牛往往在每個階段或很長事件在常人看來是“怪怪”的，比如Theodor Svedberg一開始的“不學無術”，所以需要社會有足夠的寬容性，才能形成孕育天才和大牛的溫床。
2. 給錢，給人，給資源
有了牛人，要快速形成資源的聚集效應，給錢，給人，給資源，這樣可以快速吸引眾多優(yōu)秀人才的聚集效應，筑巢引鳳，思想碰撞后產(chǎn)生好的idea的概率會大幅提高，更容易出成果。但這也是把雙刃劍，資源過于集中，容易形成學閥，學霸，形成小團體，反而不好。Theodor Svedberg引來Arne Tiselius, Arne Tiselius又吸引來他的一系列弟子，才能促成Sephadex的誕生，這可能也和那時候瑞典人骨子里的北歐海盜精神相關，更著重群體的民主和利益分配。
當下時代，牛人自帶流量光環(huán)的話，錢，人，資源會自動聚集，形成馬太效應，新型產(chǎn)業(yè)的起始發(fā)展到規(guī)模效應的時間會更短，迭代也會更快速。
3. 學術界和產(chǎn)業(yè)界的合作
老生常談的問題了。 個人認為處于學術界和產(chǎn)業(yè)界中的連接點和關鍵人物至關重要，如本例中的Bj?rn Ingelman，具備敏銳商業(yè)嗅覺，同時又是學術界出身的背景。同時學術界和產(chǎn)業(yè)界的相向而行也非常重要，學術界需要創(chuàng)新，不走尋常路，不能被產(chǎn)業(yè)界現(xiàn)有的技術路線和模式牽著鼻子走，但是在探出一條新路的起始階段，對其后續(xù)發(fā)展的路徑，所需資源，商業(yè)模式等需要積極引入產(chǎn)業(yè)界資源來合理做研判，提前規(guī)劃好專利布局，利益和資源分配，時機成熟的要早上快上，搶占戰(zhàn)略高地，對于時機尚未成熟的，要做到心中清楚需要等待哪些資源和技術路線到位，做有心人。產(chǎn)業(yè)界對于新的發(fā)現(xiàn)和路線，要有更多的開發(fā)心態(tài)，切合主業(yè)的路線如何引入，資源如何分配，對和目前主業(yè)不切合的新型技術，是體外孵化，是找合作方共同推進，還是對外license out，需要有逐步建立規(guī)范的操作體系流程。
自1959年 Sephadex 葡聚糖凝膠發(fā)明后，極大推動了色譜凝膠填料的發(fā)展，后續(xù)這個領域橫向發(fā)展出不同交聯(lián)分子量的葡聚糖，瓊脂糖，交聯(lián)瓊脂糖，高流速瓊脂糖等一系列不同填料基質，縱向上發(fā)展出除起始的尺寸排阻色譜（SEC）填料外的離子交換色譜（Ion-Exchange Chromatograhy, IEC）填料,親和層析（Affinity Chromatography, AC）填料, 疏水作用層析(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)和多模式（Multi-mode Chromatography MMC）等一系列結合不同配基的填料系列。
說到了1959年Pharmacia公司正式發(fā)布Sephadex 葡聚糖凝膠產(chǎn)品，Sephadex填料生在一個好“時代”， 1960-90年代正是分子生物學大爆發(fā)的時代， 核酸，蛋白，酶、激素和其他生物大分子，各種研究的熱點，給了凝膠色譜填料最好的舞臺。Pharmacia也從一家瑞典本土藥企進化成全球知名的分子生物學產(chǎn)品公司。但是葡聚糖凝膠填料也有其“先天”的缺陷，Sephadex由交聯(lián)的葡聚糖構成，富含羥基，具有極強的親水性。這對于生物相容性而言是好事，但是其三維網(wǎng)絡在低離子強度溶液中吸水膨脹，但在高離子強度時因外部溶液的滲透壓增加，導致凝膠脫水收縮。這一過程類似于普通水凝膠的溶脹/收縮行為。
葡聚糖Dextran化學結構式
這種情況在Sephadex被改性為離子交換樹脂（如DEAE-Sephadex、CM-Sephadex）后，帶電荷基團進一步引入。更加嚴重。
在低離子強度下：
·離子交換基團去質子化/質子化（如DEAE的氨基帶電）；
·基團間的靜電排斥力增強，導致凝膠網(wǎng)絡擴張，加劇吸水膨脹；
·分子內(nèi)排斥使得交聯(lián)結構松散，孔隙增大。
在高離子強度時：
·溶液中的反離子（如Na?、Cl?）屏蔽了固定電荷間的靜電排斥；
·凝膠網(wǎng)絡收縮，孔隙縮??；
基于葡聚糖dextran凝膠填料在不同離子強度下的體積“縮放”，同時交聯(lián)度較低，難以耐受較大壓力和高流速的缺點，在工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的時候就成了瓶頸了，所以從Sephadex凝膠填料剛一推出后，人們就開始積極尋找替代的基材。
4.聚丙烯酰胺凝膠
到這里，不出意外，色譜凝膠填料發(fā)展史上的另一位重磅人物要登場了，中國色譜界如雷貫耳的烏普薩拉大學的Stellan Hjertén教授。Stellan Hjertén對于層析填料和毛細管電泳技術發(fā)展都做出了巨大的貢獻，可以說是分析化學里好幾個方向的開山鼻祖。這里只重點講和色譜凝膠填料相關的部分。
Stellan Hjertén
Stellan Hjertén本來在烏普薩拉大學本科和碩士主攻物理學，結果被上集介紹過的1948年諾貝爾化學獎獲得人 Arne Tiselius教授慧眼識珠，收入門下做了關門弟子。而Stellan Hjertén愿意加入的原因是他觀察到烏普薩拉大學生物化學系中最成功的博士生往往是那些在物理化學或物理學方面有良好背景的人。 如同很多武俠小說的情節(jié)，師父收的關門小師弟都是比較能“折騰”的。Stellan Hjertén屬于開掛選手，第一個研究項目就發(fā)現(xiàn)了羥基磷灰石填料。剛好在開發(fā)羥基磷灰石填料用于色譜分離檢測的時候，他的兩位師兄Jerker Porath and Per Flodin給各位師弟們分配了任務，試試用交聯(lián)的葡聚糖凝膠進行電泳測試實驗。而Hjertén觀察到分析物根據(jù)大小發(fā)生了分離。并把實驗結果展示給Porath。從那時起，葡聚糖凝膠就僅由Porath和Flodin進行研究，并且只研究它們的色譜特性，結果就是上集里說到的Sephadex的上市。Hjertén的名字沒出現(xiàn)在申請的專利和發(fā)表的文章上，有點遺憾。但是塞翁失馬，焉知非福，由于不能再對葡聚糖凝膠進行研究，反而讓Hjertén轉向研究非葡聚糖類凝膠的研究，開拓一片新天地，不對，確切說是好幾片新天地。由于Hjertén正好在用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分子篩， 因此順理成章地試試這些凝膠用于色譜分子篩。不試不要緊，一試嚇一跳，非常大的蛋白質也可以通過聚丙烯酰胺凝膠過濾進行分離，效果非常好。
Bio-Rad Laboratories（伯樂）公司一開始是個夫妻店起家，David and Alice Schwartz夫婦都是加州伯克利大學的，畢業(yè)后開了這家公司，一開始主要提供生物分子的標記，那時候標記可主要用的放射性核素標記哦，所以Bio-Rad的 Biochemical-Radiochemical的縮寫結合，看來那個時候公司和產(chǎn)品取名都好這口。
Schwartz夫婦和Bio-Rad早期團隊
David Schwartz一直和Tiselius保持著良好的私人關系，密切關注著這個研究組的科研進展，這時候既然Pharmacia公司不感興趣，Bio-Rad公司迅速介入，連帶著之前的羥基磷灰石填料，加上聚丙烯酰胺分離介質，好東西統(tǒng)統(tǒng)都要?；贖jertén發(fā)現(xiàn)的聚丙烯酰胺介質和后續(xù)開發(fā)大規(guī)模制備聚丙烯酰胺填料微球的技術，Bio-Rad公司在1964年推出了Bio-Gel? P 色譜凝膠填料 （P=polyacrylamide），從而在分析科學市場，特別是蛋白質分離市場一炮而紅，成了Pharmacia公司的主要競爭對手之一。此后，Pharmacia Fine Chemicals （1967 年從Pharmacia里單獨成立，專門針對非藥物產(chǎn)品市場）（生產(chǎn)葡聚糖凝膠， Sephadex）和Bio-Rad（生產(chǎn)聚丙烯酰胺凝膠，Bio-Gel? P）之間的競爭極大促進了這些填料的持續(xù)改進。
Bio-Rad的Bio-Gel? P
有意思的是，后來Pharmacia公司認識到此類產(chǎn)品的重要性，推出了通過丙烯基葡聚糖與N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺共聚形成的復合凝膠產(chǎn)品，商標為Sephacryl。
早期Sephacryl S系列產(chǎn)品宣傳材料
科研中的積極心態(tài)
目前各種國產(chǎn)化替代的過程，基本是有已知的明確參照物，體系和參數(shù)指標的，但后續(xù)進入深水區(qū)，“無人區(qū)”，需要開拓新方向和新目標的時候，沒有參照物了，這個時候積極的心態(tài)非常重要，Hjertén教授在回憶錄里有句名言“如果我也參與了Dextran凝膠（Sephadex?）的開發(fā)，聚丙烯酰胺凝膠（和瓊脂糖凝膠）可能永遠不會被用于分子篩（這無疑會阻礙生命科學的發(fā)展）。這只是我在研究中，以及在一般生活中經(jīng)驗性發(fā)現(xiàn)的一個“規(guī)則”：一個在開始時看似消極的實驗或事件，從長遠來看，當從正確的角度看待它時，結合其他實驗和事件，可能會帶來積極的結果。”
英文里有個專門詞匯對應這類現(xiàn)象：Serendipity ，類似中文里的“無心插柳柳成蔭”。我們后續(xù)需要引領科技發(fā)展前沿的話，可能還需要多一些這樣的“運氣”和孕育這樣運氣的環(huán)境。
初創(chuàng)公司的突破
1950-60年代，美國出現(xiàn)了一批初創(chuàng)公司，采用一種快速、高效的商業(yè)化實驗室產(chǎn)品的模式，Bio-Rad公司就是采用這種打法，利用聚丙烯酰胺色譜凝膠填料一戰(zhàn)成名，讓Pharmacia這個歐洲傳統(tǒng)藥企公司有點措手不及，所以后續(xù)Pharmacia把非藥產(chǎn)品剝離出來，單獨成了Pharmacia Fine Chemicals公司來應對，這才催生了后續(xù)更強大的凝膠色譜填料系列產(chǎn)品。
接下來是最重磅的瓊脂糖凝膠填料登場，故事更加精彩。
葡聚糖和聚丙烯酰胺色譜凝膠填料的發(fā)現(xiàn)和產(chǎn)品上市，但是這兩個系列填料有幾個先天不足的缺點。
1.機械強度不夠，無法上高壓力，這就意味無法提供高流速，大規(guī)模工業(yè)應用上受限。
2.填料內(nèi)部孔徑還不夠大， 無法分離大分子量蛋白質或生物體，如病毒或核糖體。
3.葡聚糖填料在緩沖液的離子強度變化時會膨脹或收縮。
4.聚丙烯酰胺的單體丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，同時也是致癌物質
隨著1959年葡聚糖凝膠在色譜分離的應用的文章發(fā)表后，人們開始在各種類似葡聚糖結構的糖類里淘寶，由于前面介紹的Tiselius教授的研究小組也在尋找一種與自由區(qū)帶電泳實驗相似的介質，即無分子篩效應的凝膠，有人報道過使用瓊脂（Agar）作為凝膠來跑電泳，但由于存在帶電基團，效果并不怎么好。（具體瓊脂和瓊脂糖的區(qū)別及它們的前世今生，也是非常有趣的故事，后續(xù)值得來個番外篇）。
但是前面介紹的大牛Hjerten教授卻沒輕易放棄，他研究了許多關于瓊脂化學結構的文章后，了解到一位日本研究人員Choji Araki（荒山朝次）早在1937年就發(fā)現(xiàn)瓊脂由兩種多糖組成：一種帶電的，他稱之為瓊脂糖醛酸，和一種不帶電的，瓊脂糖。（目前的定義：瓊脂是一種與硫酸酯、丙酮酸和甲基基團不同程度取代的多糖混合物，而瓊脂糖就是其中具有最低電荷含量的部分）。（其實日本人是最早研究瓊脂和瓊脂糖結構，結果分別被德國人和瑞典人分別截胡，做成了微生物學和分子生物學的兩門大生意）。
瓊脂糖Agarose的化學結構式
瓊脂糖是由瓊脂二糖(agarobiose)重復單元組成的線性聚合物，瓊脂二糖是由 D-半乳糖（D-galactose）和3,6-脫水-L-吡喃半乳糖（3,6-anhydro-L-galactopyranose）組成的二糖。n大約是350-400 （瓊脂糖的平均分子量約為120,000）。了解到瓊脂和瓊脂糖的不同，一下子就打開了局面，那就從瓊脂里面來提取瓊脂糖，從定義來說也比較直接，就是去掉瓊脂里帶電的部分，留下不帶電或帶電極少的部分。科學家開發(fā)了不少方法來干這個，如下表。
從瓊脂中提取瓊脂糖的方法列表
獨特的化學結構造就了瓊脂糖獨特的性質
1.3,6-脫水-L-半乳糖殘基中的分子內(nèi)醚鍵（C3與C6之間的鍵）（上圖中紅色虛線圈）是凝膠化的關鍵，促進雙螺旋結構的形成。
2.瓊脂糖雙螺旋通過另一組氫鍵聚集成三維網(wǎng)絡纖維，圍繞大量水分形成相互連接的孔隙。由于結構靠氫鍵支撐，所以對于高溫和高鹽還是會破壞瓊脂糖凝膠的結構圖片。瓊脂糖可逆凝膠化過程：從隨機線圈形成雙螺旋（三級結構）并最終形成大網(wǎng)絡結構。
4% 瓊脂糖凝膠掃描電子顯微鏡照片
3.凝膠溫度(Gelling temperature)和熔融溫度(Melting Temperature)的滯后(Hystersis)現(xiàn)象, 及凝膠溫度遠遠低于熔融溫度，使得瓊脂糖凝膠在常溫下始終保持凝膠狀態(tài)，只有加熱到很高的溫度才會熔融，極大地擴展了應用便利性。4.瓊脂糖鏈上的羥基賦予其強親水性，使其對蛋白質等生物分子吸附極低，適合生物分離。
5.瓊脂糖凝膠的孔徑隨濃度增加而減小，適合大分子分離。
6.瓊脂糖的羥基可通過溴化氰、環(huán)氧氯丙烷等活化，偶聯(lián)配基，實現(xiàn)不同的功能化。
7.瓊脂糖凝膠僅靠氫鍵所以機械強度低。通過化學交聯(lián)可穩(wěn)定螺旋結構，提高耐壓性和耐極端pH能力。交聯(lián)不改變孔徑，但顯著提升剛性。
8.瓊脂糖相較于它的原材料瓊脂而言殘留的硫酸根和丙酮酸基團極少，將電內(nèi)滲（electroendosmosis，EEO）的影響降至最低，所以也非常適合對帶電的生物大分子的電泳分離，常見的實驗室跑膠，多指的就是采用瓊脂糖凝膠電泳分離帶負電的核酸分子。
9.瓊脂糖的結構對酶解和水解都具有比較好的抵抗力
不同濃度瓊脂糖微球填料（未交聯(lián)+交聯(lián)）對比聚丙烯酰胺填料的分離分子量范圍
有了這些獨特的優(yōu)良性質，加上之前開發(fā)聚丙烯酰胺填料的經(jīng)驗，。Hjerten先是開發(fā)了簡化的大規(guī)模瓊脂糖制備技術（1961-1962年），解決了早期瓊脂因帶電基團導致的吸附和電內(nèi)滲問題，然后就依葫蘆畫瓢，于1964年首次報道了制備瓊脂糖微球用于色譜分離。 
這次Pharmacia公司不會再錯過了， 馬上合作，并于1967年推出了商業(yè)化銷售的瓊脂糖色譜凝膠微球產(chǎn)品，商品名為Sepharose（Separation, Pharmacia, Agarose）。如上面總結的瓊脂糖的獨特化學性質，難以找到具有相同或更好的色譜性能的替代品于是它們在實驗室和工業(yè)生產(chǎn)上廣受歡迎。Sepharose和基于瓊脂糖微球的系列產(chǎn)品迅速成為Pharmacia公司利潤最高的色譜填料產(chǎn)品—直到今天仍然是。從Sepharose推出之后，圍繞瓊脂糖微球填料的進一步改進和功能化就在不斷進行。主要是以下幾個方面：
1.交聯(lián)技術的改進
l 早期交聯(lián)：Porath等人（1971年）引入二溴丙醇和雙環(huán)氧化合物交聯(lián)，提高了機械穩(wěn)定性，基于此，Pharmacia在1975年推出了形成Sepharose CL系列產(chǎn)品 （CL=Cross-Link, 交聯(lián)）
l 鹽存在下交聯(lián)：Laurent和Axelsson發(fā)現(xiàn)高濃度鹽可收縮瓊脂糖纖維，促進交聯(lián)劑滲透，開發(fā)出Sepharose Fast Flow系列（1985年），耐壓性顯著提升，為工業(yè)規(guī)模的應用鋪平了道路。
l 組合交聯(lián)劑：Pharmacia公司（1982年）采用短鏈（環(huán)氧基）和長鏈（碳鏈）雙交聯(lián)劑組合，推出Superose系列，孔徑分布更優(yōu)
l 預交聯(lián)技術：在瓊脂糖溶液中加入含活性/非活性基團的雙功能交聯(lián)劑（如烯丙基縮水甘油醚），凝膠化后激活非活性基團，實現(xiàn)高效交聯(lián)，用于Capto系列
Sepharose系列產(chǎn)品時間表
針對瓊脂糖凝膠微球交聯(lián)技術不斷優(yōu)化，就是保持孔隙和比表面積特點的同時，不斷提高耐壓性，同時對極端pH及有機溶劑有一定耐受性，并且可以高壓滅菌，再加上Pharmacia公司于1982年推出的Fast protein liquid chromatography (FPLC)硬件系統(tǒng)的配合，一下子打通從實驗室到工廠的全系列應用鏈條。這部分基本就是今天的AKTA系列的前身。
早期的FPLC儀器設備
AKTA Avant 儀器設備
2.羥基活化瓊脂糖結構中有大量的羥基可以作為活化的位點，除了做交聯(lián)外，也可以在活化后結合其他的功能基團，從而徹底打開瓊脂凝膠填料應用的天花板。相當于利用交聯(lián)的瓊脂糖作為基礎骨架，在上面可以接出不同功能的配基來實現(xiàn)基于不同模式（如電荷-離子交換，親和，疏水，多模式等）的分離。
瓊脂糖微球羥基活化主要有以下幾種：
溴化氰（CNBr）活化：1967年由Axen等首次引入多糖材料活化，但存在異脲鍵不穩(wěn)定、配基易脫落的問題。同時溴化氰有毒性。
環(huán)氧氯丙烷活化：作為CNBr的替代方案，因其低毒性和高活化率被廣泛應用，但受限于其在水中的溶解度。
烯丙基縮水甘油醚活化：一端環(huán)氧基與瓊脂糖羥基反應，另一端惰性雙鍵減少副反應，同時后續(xù)可以進一步活化雙鍵，根據(jù)需求上不同配基，大大提高了反應的可控性和靈活性。
NHS活化：對伯胺基配基偶聯(lián)速度快、效率高且酰胺鍵在堿性條件下下穩(wěn)定。
二乙烯基砜（DVS）：用于羥基載體活化，偶聯(lián)氨基、巰基等，但堿性條件下不穩(wěn)定。
還原氨化法：通過NaIO4氧化生成醛基，與伯胺形成希夫堿后還原為穩(wěn)定仲胺鍵，但后續(xù)容易有美拉德副反應，微球易變黃。
上述方法中加深的部分為現(xiàn)在比較主流應用的瓊脂糖凝膠微球活化方法
3.配基修飾
羥基活化好了，接下來就結合不同的應用和分離模式來上結合不同的配基。
- 離子交換-Ion Exchanger (IEX)
陰離子交換（Anion Exchanger, AEX）
弱陰離子交換就用DEAE
陽離子交換 (Cation Exchanger, CEX)
這個一般都用磺酸基團，Sulfonate group, 所以商品名帶 S
- 疏水作用（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）
比如Butyl- =結合丁基 Phenyl- =結合苯環(huán)，Octyl-=結合辛基，疏水性依次增強
- 多模式作用（Multi-Mode Chromatography, MMC）
紅框的羧基提供負電荷，藍框的苯基提供疏水作用，綠框的羰基可以作為氫鍵的受體，而黃框的氨基則可以作為氫鍵的供體。
- 親和作用 (Affinity Chromatography, AC)
Protein A是1958年在金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus細胞壁上發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，分子量約為42 kDa，包含從N端到C端的五個同源結構域：E、D、A、B和C （每個結構域有58個氨基酸殘基），每個結合域都能與多種哺乳類動物的免疫球蛋白結合，最主要為IgG。Protein A能與大多數(shù)免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域結合，當Protein A與免疫球蛋白結合后，這些免疫球蛋白便失去了作用，進而摧毀免疫系統(tǒng)的吞噬作用及調(diào)理作用。這也就是金黃色葡萄球菌致病的厲害之處，驚不驚喜，意不意外，好的科學發(fā)現(xiàn)就是從大自然里學習，變廢為寶，化害為利。更有意思的是，早期的Protein A的純化，采用的就是我們之前提到的Sephadex色譜填料。
Protein A一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，馬上就引起了搞凝膠色譜填料的科學家的關注，這不就是夢寐以求的親和配基嗎，剛好那段時間，Porath的團隊投入了大量精力在研究如何在Sephadex凝膠微球上引入不同的蛋白和酶，1966年人們剛發(fā)現(xiàn)Protein A與IgG的特異性作用后，馬上就利用現(xiàn)成的活化后引入配基的技術，把天然Protein A接到了瓊脂糖微球上，形成了第一代的親和瓊脂糖色譜填料。短短一年左右，團隊在Nature上前后發(fā)表了三篇相關文章，多么美好的時代。也充分說了在凝膠色譜填料固定化結合酶和各種生物活性分子的重要性和對后來分子生物學發(fā)展的推動作用。
A) 蛋白A基因序列：信號序列（S）、五個IgG結合結構域（D、E、A、B和C）和細胞壁結合區(qū)（XM），B) IgG的Fc區(qū)與蛋白A的B結構域之間的相互作用示意圖。
Protein A凝膠親和填料的發(fā)展史基本就是一部重組蛋白工程化史，工程化努力都集中在提高更高的結合載量、延長填料使用壽命、提高穩(wěn)定性，以增強其在暴露于嚴苛條件（如和洗脫步驟中的酸性pH和原位清洗（CIP）的堿性pH）的耐受性。我們還是以（Pharmacia-Amersham-GE Healthcare-Cytiva）的protein A瓊脂糖填料系列的發(fā)展史為例來講。
GE Healthcare公司的Protein A瓊脂糖填料演化史圖
最開始比較簡單直接，就是從天然蛋白A結構中去除不必要的部分，去掉信號序列S，去掉細胞壁結合區(qū)XM，效果不錯，這種做減少了天然Protein A的非IgG Fc結合區(qū)域與蛋白質的非特異性結合， 提高了洗脫的單抗的純度，同時采用大腸桿菌進行表達，也避免了動物源污染風險。據(jù)此1996年推出了rProtein A Sepharose FF，其重組Protein A包含五個串聯(lián)結構域：E、D、A、B、C。盡管去除了非結合域，僅保留五個結構域，但每個域均可與IgG的Fc段結合，且結合強度略有差異，導致洗脫條件不一致，常需要低pH值。劇烈的洗脫條件易使單抗變性、形成聚集體或復性困難，對敏感型單抗不利。
那么如果減少串聯(lián)結構域的個數(shù)，并且采取同型結構域串聯(lián)，應該有幫助，于是MabSelect產(chǎn)品于2001年誕生了，采用了B結構域的四聚體形式的重組Protein A，同時在C 端導入半胱氨酸，通過硫醚鍵與環(huán)氧基團活化的瓊脂糖微球定向偶聯(lián)，在提高結合載量的同時，也消除了不同結構域與抗體Fc 段親和性的差異，使得洗脫條件更溫和而均一。（注意：Pharmacia公司在1997年和英國的Amersham 合并成立了Amersham Pharmacia Biotech，這個產(chǎn)品一炮而紅，讓合并后的公司從以實驗室產(chǎn)品為主趁著單抗藥物發(fā)展的東風，一把殺進了工業(yè)規(guī)模，Amersham的財報年年必提MabSelect.）
但是CIP過程中的耐堿性怎么辦呢，總不能清洗幾個循環(huán)就不能用了，不耐堿的活，脫落的Protein A配基對于藥物安全性也是個大問題。那接著對Protein A工程化改造吧， 這個時候，科學家對于B結構域的氨基酸序列已經(jīng)理解比較深入了，首先人工造出了個B 結構域的功能類似物和能量最小化版本，稱為Z結構域，同時替換了天冬酰胺殘基（對堿最敏感的氨基酸，使蛋白質容易脫酰胺），創(chuàng)建了一個z結構域四聚體配體， 同時包含一個 C 端半胱氨酸，通過硫醚鍵和環(huán)氧化物間隔臂與高交聯(lián)的瓊脂糖微球進行定向偶聯(lián)。這樣在2005年誕生了經(jīng)典的MabSelect Sure耐堿型的Protein A填料。 具有非常低的配體脫落，同時選擇性定向提供了更高的結合載量。
后續(xù)的MabSelect PrismA將配基Z結構域四聚體提高為六聚體，從而進一步提高了單抗結合載量和耐堿性。
最新的Protein A凝膠填料為MabSelect PrismA X和MabSelect SuRe 70 應該也是在結合載量和耐堿性上進行提高和改進。比如瓊脂糖粒徑變小點，這樣可以在相同體積下，增加更多的表面積來增加配基密度，從而實現(xiàn)更大的結合載量?；蛘咄ㄟ^延長柱內(nèi)的停留時間來提高結合載量。
從瓊脂糖凝膠色譜填料的發(fā)展歷史，可以預見
1.瓊脂糖因為其獨特的化學結構導致的獨特性質使其在目前各類凝膠中脫穎而出，成為最主流和工業(yè)規(guī)模應用最多的凝膠層析填料基材，后續(xù)的進一步的發(fā)展和突破需要有更優(yōu)異性能的基材，在保持親水性，生物相容性，可修飾性的基礎上，在孔隙率，連通率和機械性能上實現(xiàn)更好好的平衡點。 現(xiàn)有的聚合物類的填料已經(jīng)形成了沖擊之勢，但還需要進一步解決親水性和生物相容性的問題。
2.固定化和偶聯(lián)化學的方法已經(jīng)相對比較成熟，后續(xù)發(fā)展的關鍵在于配基。特別針對親和色譜，好的配基是決定成敗的關鍵。由于瓊脂糖本身的化學結構和性質的限制，同時考慮到配基與分離目標分子作用的空間位阻效應，最終的配基密度會有一個天花板。
3.新型的瓊脂糖微球制備工藝，比如膜乳化造球，噴射造球，微流控通道造球等，會對傳統(tǒng)的水/油相乳化法形成挑戰(zhàn)和沖擊。
4.非色譜柱類分離方法的挑戰(zhàn)，因為藥物生產(chǎn)的保守性，以及打破已有的工藝體系，重建新的工藝路線和體系的成本考量，在沒有體現(xiàn)出較大的性能和/或經(jīng)濟效益之前，還需要時日，畢竟凝膠色譜填料發(fā)現(xiàn)，上市，從實驗室規(guī)模到大規(guī)模工業(yè)應用規(guī)模，是從上世紀50年代一直持續(xù)到現(xiàn)在，已經(jīng)接近80年的時間，需要好幾代人持續(xù)不斷的工作。
生物工藝產(chǎn)品，特別是凝膠色譜填料國產(chǎn)化替代之后的科技引領，新技術，新產(chǎn)品，新體系的打造該怎么做，希望本系列的內(nèi)容能帶來一些思考和啟示！
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