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近期有媒體及專家反映新型冠狀病毒核酸檢測陽性率低、有的病例重復(fù)檢測多次陰性后出現(xiàn)陽性結(jié)果、咽拭子標本多次檢測陰性但最后在呼吸道灌洗液標本中檢測出陽性結(jié)果、CT影像篩查出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎特征但核酸檢測陰性等問題。經(jīng)過與臨床分子診斷學專家、臨床檢驗醫(yī)學專家、臨床呼吸病醫(yī)學專家、臨床影像醫(yī)學專家交流，現(xiàn)提出自己的一點看法。

一、關(guān)于核酸檢測在新型冠狀病毒肺炎患者診斷中的應(yīng)用

新型冠狀病毒肺炎（Novel Coronavirus Pneumonia, NCP）是由2019新型冠狀病毒（2019 Novel Coronavirus, 2019-nCoV）感染引起的一種急性傳染性疾病，而確定診斷的金標準就是能在患者體內(nèi)找到2019-nCoV的存在。核酸檢測就是檢測2019-nCoV基因中某些特定核酸序列的存在，因此從方法學層面考慮其作為實驗室診斷金標準沒有任何疑問，而CT（電子計算機斷層掃描）作為臨床影像學篩查指標具有重要價值，但無論從早期診斷、鑒別診斷、排除診斷還是最終確診等方面都還具有一定的局限性，更無法替代病原學診斷。其實任何疾病本身都具有分層診斷的概念，在感染性疾病的診斷中，臨床表現(xiàn)、流行病學史、影像學、病原學等指標都發(fā)揮重要作用，但病原學診斷肯定是最精準的診斷。當然我們在重視核酸檢測在病毒感染診斷中的重要價值的同時，也要客觀考慮由于其方法學特點、疾病發(fā)展過程、標本采集、標本保存與運輸、核酸提取、擴增體系、人員操作等因素都可能造成最后檢測結(jié)果的假陰性或假陽性。

二、關(guān)于2019-nCoV核酸檢測方法

目前，無論是臨床實驗室還是疾病控制中心（CDC）實驗室，普遍應(yīng)用的是實時熒光RT-PCR方法，此檢測方法成熟可靠，并已在常規(guī)檢驗和科研實驗中被廣泛應(yīng)用。該方法是將標本中的特定核酸序列進行擴增，理論上每一次擴增后的核酸數(shù)量都是成倍增加，經(jīng)過30次以上擴增后，其核酸數(shù)量達到足夠通過熒光等常規(guī)方法進行檢測。如果有人說目前實驗室所用2019-nCoV核酸檢測方法不可靠，可能是因為其對該方法原理和臨床應(yīng)用不了解。實時熒光RT-PCR方法從采集標本送到實驗室，經(jīng)過對標本的接收、處理（有時從安全考慮需要滅活處理，這點對于生物安全至關(guān)重要，但也有專家提出可能影響檢測效率）、病毒核酸提取、核酸擴增、數(shù)據(jù)處理及報告，一般需要約4個小時或更長時間，如何改進核酸提取和擴增流程，縮短整個檢測時間是迫切需要解決的問題。目前也有個別廠家的檢測試劑檢測的不是2019-nCoV核酸而是病毒進入機體后機體產(chǎn)生的抗體，病毒進入機體到機體產(chǎn)生特異性的抗體需要一段時間（窗口期），因此檢測到病毒抗體肯定滯后于檢測到病毒核酸。病毒抗體檢測一般用于篩查手段及流行病學調(diào)查，其敏感性、特異性、臨床應(yīng)用效率還需要進一步的驗證和評估。

三、2019-nCoV核酸檢測陽性率低等問題

（一）患者的病程與病情
NCP患者的發(fā)病都會經(jīng)歷一個從感染后無癥狀，到輕度癥狀出現(xiàn)，再到嚴重癥狀出現(xiàn)的過程。不同病程、不同病情患者機體中的病毒存在量可能不同（已有病毒感染，但由于在相關(guān)部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于現(xiàn)有方法檢測不到，也稱窗口期）。因此，對臨床高度疑似NCP患者，應(yīng)該連續(xù)采集標本進行核酸檢測（這可能是臨床患者多次檢測陰性，陽性結(jié)果出現(xiàn)晚的主要原因之一）。其實任何病原學檢測，都不能只根據(jù)一次陰性結(jié)果而做出排除性診斷，更不能根據(jù)核酸檢測陰性而漏診臨床高度疑似的NCP患者，尤其在高發(fā)地區(qū)，在大面積流行期間。

（二）標本采集、運輸及保存
1、標本采集部位：很多專家從實踐工作中總結(jié)出的經(jīng)驗認為，鼻咽拭子標本2019-nCoV核酸檢測陽性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液標本陽性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的標本（這也是這兩天被廣泛評論的某患者咽拭子標本三次核酸檢測陰性，收住院后在搶救過程中采集肺泡灌洗液標本核酸檢測陽性的原因），但下呼吸道的痰、肺泡灌洗液標本采集難度大、易引起患者噴射導(dǎo)致采集操作者感染風險大，一般情況不建議使用（氣管切開、上呼吸機搶救病人可用）。近期發(fā)布的第五版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》已將標本采集“咽拭子”更新為“鼻咽拭子”。為了提高檢測陽性率，建議采集同一病人多部位標本，合并進行檢測。比如，用口咽拭子、鼻咽拭子同時采集標本，然后放到同一采集管中送檢。對于有消化道癥狀的疑似患者，同時采集糞便或肛拭子進行檢測。

2、標本采集方法：近期用于2019-nCoV核酸檢測標本主要是口咽拭子，采集時讓患者張大嘴后用特制棉簽或小刷頭刮取其咽部采集帶病毒標本。如果平時醫(yī)護人員咽拭子取樣不多，刮取標本時患者的反應(yīng)又比較大，往往導(dǎo)致刮取標本的位置不對，或力度和時間不夠，沒有刮取到帶病毒的標本或刮取到的帶病毒標本量少，最后導(dǎo)致檢測結(jié)果陰性。

3、標本運輸及保存條件：2019-nCoV為RNA病毒，很容易被外源性或細胞破壞后所釋放的RNA酶降解，而影響最后的檢測效率。嚴格來講標本采集后應(yīng)及時送到實驗室（疾控中心、醫(yī)院檢驗科、第三方實驗室），盡快完成檢測。標本在常溫條件下放置時間過長（幾個小時、十幾個小時、二十多個小時或更長時間），也可能是造成最后檢測結(jié)果假陰性的原因。近期有人提出使用防病毒核酸降解標本采集管，但目前此類產(chǎn)品數(shù)量少、成本高、實際應(yīng)用效果也需要進一步評價。建議標本采集后及時送檢，及時檢測（4小時）。如因某些原因標本采集后不能及時送檢或及時檢測，應(yīng)將其置于4℃保存（24小時）。24小時內(nèi)不能檢測的標本，建議于-70℃以下保存并避免反復(fù)凍融。

（三）核酸檢測試劑
1、核酸提?。荷厦嬉褦⑹鲞^2019-nCoV核酸檢測需要對所采集標本中核酸進行提取。目前臨床實驗室所用方法有手工提取和機器自動或半自動提取，通常情況下機器自動提取方法的效率要優(yōu)于手工提取。而不同提取試劑和手工提取流程的掌控對最后提取到的核酸數(shù)量和質(zhì)量可能存在差別，而從標本中所提取出的核酸數(shù)量和質(zhì)量對于檢測方法中下一個步驟核酸擴增至關(guān)重要，從而也就直接影響最后的檢測結(jié)果。

2、核酸擴增試劑：由于不同廠家試劑研發(fā)是根據(jù)2019-nCoV核酸Orf1ab、N、E、S等基因的特異性序列設(shè)計的擴增探針（不同廠家的擴增試劑可分為1個、2個或3個靶標基因位點檢測試劑），試劑中酶、金屬離子等成分與質(zhì)量的差異，都可能影響擴增效率和最后檢測結(jié)果的靈敏度。

3、試劑應(yīng)用的特殊性：由于導(dǎo)致本次疫情的是2019-nCoV，加上其突發(fā)性，試劑生產(chǎn)商只能根據(jù)有限公開的病毒核酸研究數(shù)據(jù)開展試劑研發(fā)，國家相關(guān)部門最早推薦了一些廠家的檢測產(chǎn)品，后來又審批了一些廠家檢測試劑的注冊申請。目前開展2019-nCoV檢測試劑研發(fā)生產(chǎn)的廠家已超過百家，正常情況下一個臨床檢測試劑產(chǎn)品從研發(fā)到應(yīng)用需要通過一系列的臨床驗證與評估，但由于本次疫情的特殊性，時間的緊迫性，所研發(fā)試劑來不及完成正常流程，特別是無法得到一定數(shù)量臨床患者標本的驗證。對于臨床某些高度疑似病例，或檢測結(jié)果難以確定病例，建議用2種以上試劑進行檢測、驗證。

（四）核酸擴增儀器
目前不同實驗室用于2019-nCoV核酸檢測的儀器（PCR儀或核酸擴增儀）種類有所不同，價格上從幾萬、十幾萬、數(shù)十上百萬不等，不同的設(shè)備對檢測過程中不同溫度的控制精度、對熒光信號檢測敏感度等不同，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異。

以上是對近期媒體及專家反映2019-nCoV核酸檢測陽性率低等問題其可能原因的一些分析，由此可以理解，目前2019-nCoV核酸檢測中各種原因引起的這樣或那樣的問題是現(xiàn)實存在的，也是難以避免的。我們不能因為這些問題的存在而普遍懷疑、甚至否定目前實驗室2019-nCoV核酸檢測結(jié)果。目前2019-nCoV核酸檢測大多在三級醫(yī)院或CDC二級以上實驗室開展，這些實驗室的管理水平、技術(shù)人員素質(zhì)、檢驗設(shè)備的先進程度、檢驗過程的質(zhì)量控制措施等方面可以說大都是處于國際先進水平，而各實驗室也在通過工作開展中的回顧總結(jié)或通過實驗室之間的經(jīng)驗交流，不斷改進、完善2019-nCoV核酸檢測方法。

近期中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會也組織了相關(guān)方面專家對2019-nCoV核酸檢測進行了探討，并出臺了2019-nCoV核酸檢測相關(guān)專家共識，同時一些新的基因檢測平臺也在不斷研發(fā)。隨著基因測序、數(shù)字PCR、RT-PCR毛細管電泳等技術(shù)的應(yīng)用（國家衛(wèi)健委發(fā)布的“新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案--試行第五版 修正版”中已將病毒基因測序與實時熒光RT-PCR核酸檢測列為實驗室確診方法），2019-nCoV核酸檢測中的問題肯定會得到持續(xù)改進。