漫談人工抗原的偶聯(lián)方法
抗體是生命科學研究中不可或缺的工具之一，應用范圍包括蛋白質表達檢測和鑒定、蛋白質加工、蛋白質在細胞內的定位、免疫中和反應、蛋白質同源結構域研究、蛋白質純化以及疾病的免疫診斷和治療。盡管抗體的制備過程不存在技術難點，但是抗原的選擇以及所制備抗體的用途對能否獲得一個優(yōu)質高效的抗體至關重要。以下將對抗原多肽的設計、偶聯(lián)策略等逐一介紹.
1、抗原設計
首先選擇合適的多肽序列，明確最終產物的用途對選擇序列非常重要。如果僅僅需要生產針對蛋白質某個區(qū)域的特異抗體，比如研究蛋白質N端的前提物，我們就需要設計N末端的多肽抗原。如果抗體的使用目的是識別修飾的氨基酸，如磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸或者酪氨酸，乙?；嚢彼岬龋捅仨殞Χ嚯倪M行相應的修飾。如果抗體最終用來識別自然狀態(tài)下的蛋白質，對抗原的設計就要求更高。一般情況下抗血清能夠識別用來免疫的多肽序列，但是不一定識別蛋白質的折疊結構。蛋白質的抗原決定簇一般由6－12個氨基酸構成，呈連續(xù)性或者非連續(xù)性序列。連續(xù)性抗原決定簇由連續(xù)的氨基酸序列構成，而非連續(xù)抗原決定簇包括一組非連續(xù)氨基酸，這些氨基酸由于蛋白質的折疊而形成在空間上相互毗鄰。針對連續(xù)性抗原決定簇的抗體能夠識別沒有被埋藏在蛋白質內部的序列，而非連續(xù)性抗原的抗體能否識別抗原決定簇取決于用于抗體生產的多肽是否存在二級結構。
氨基酸序列的親水性、表露性、柔韌性決定了多肽的抗原性。許多水融性的自然狀態(tài)下的蛋白質其親水序列暴露在外測，而疏水性氨基酸序列包埋在內部。抗體結合蛋白質表面的抗原決定簇，另外抗原決定簇柔韌性比較高。蛋白質的C末端經常暴露在外測并且有較高的柔韌性，因此經常被用來作為抗體生產的抗原。但是如果C末端是跨膜蛋白質的膜內部分，該序列可能由于疏水性太強而不適合用來作為抗原。同C末端序列類似，蛋白質的N末端序列也經常暴露在蛋白質的表面，同樣為首選抗原序列。
預測蛋白特性（例如親水性、疏水性）及二級結構（例如α－螺旋，β－折疊，β－回旋）的一些算法有助于選擇表露性較高，有抗原性的內部序列以用于抗體生成。常見預測性算法有如下三種，Hopp及Woods所描述的親水性曲線給蛋白序列中的每一個氨基分配一個平均親水性值，對于一系列的相鄰氨基，平均親水性的最高點通常就位于抗原決定簇或在其附近。Kyte 及 Doolittle 所提出的另一算法略有不同，它主要是衡量蛋白序列的親水性及疏水性趨勢，該算法對于預測某蛋白的外部及內部區(qū)域非常有用。蛋白的二級結構則可以通過CHOU/FASMAN 或 LIM 所提出的算法來預測。表露性或易接近區(qū)常常和螺旋區(qū)或延展的二級結構區(qū)相鄰。并且，具有β－回旋或雙性螺旋特性的序列區(qū)也具有較好的抗原特性。目前有許多商用軟件包都使用了這些不同的算法，例如MacVectorTM，DNAStarTM及PC-GeneTM。要想預測準確，不能只使用一種算法。結合各種不同的預測方法來預測抗原性區(qū)域，可使成功率大大提高。
抗原性區(qū)域確定以后，接下來要確定多肽的長度。關于選定多肽長度有兩種不同的觀點。一種觀點認為長的多肽（20－40個氨基酸）比較好，因為長的多肽無疑會增加抗原基的數(shù)量。另一種觀點則認為小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所產生抗體的位點特異性。但有一點是明確的，不管長度如何，所選多肽必須能夠較容易地通過生化合成得到，并且能溶解到水溶性緩沖劑進行載體蛋白的耦聯(lián)。由于受副反應的影響較大，高于二十個氨基酸的多肽通常很難進行高純度合成，并且常常會含有缺失性序列。另一方面，太短的多肽（<10個氨基酸）則會產生識別特異性很強的抗體，以至于無法識別整體蛋白，或親和性很低。因此綜合考慮制備性抗原地多肽有效長度一般是10－20個氨基。這種長度的多肽序列會最大程度的減小生化合成困難，具有一定的水溶性，也會具有一定程度的二級結構。
2、抗原準備－耦聯(lián)方法
化學合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導動物產生很弱的免疫反應，因而與載體蛋白耦聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T－幫助細胞，進而誘導B－細胞反應。用于與多肽耦聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最常用的是keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）, 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲狀腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽耦聯(lián)載體。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經常被用做檢測試驗的阻斷劑而使得該方法生產的抗體在應用上存在著一定的局限性。
設計合成性多肽常常被忽略的一個方面是如何將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。例如，N－端序列需要通過C－端氨基酸耦聯(lián)，而C－端序列則需要通過N－端氨基酸耦聯(lián)。內部序列則可以耦聯(lián)到任何一端。內部序列耦聯(lián)的另一考量則是將非共軛端?；虬被驗樵鞍追肿有蛄兄胁粫袔щ姾傻哪┒?。最常用的耦聯(lián)方法都是基于自由氨基(alph-氨基 或 Lys)、sufhydryl (Cys)或羧基集團(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在。所有的耦聯(lián)方法都應該是通過羧基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。所選序列不能有多個殘基都能參與所選耦聯(lián)化學反應。如果多個反應位點存在，可以考慮將多肽序列縮短，或者選擇所有反應位點都位于一端的多肽。對于內部序列通常會使用離所預測抗原位點較遠的一端進行耦聯(lián)，這樣可以避免可能的屏蔽問題。
除非研究人員另做說明，我們通常使用EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)或carbodiimide 方法將多肽和載體進行耦聯(lián)。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的側鏈羧基集團及末端羧基集團，使之與主胺基發(fā)生耦聯(lián)反應。激活的多肽與載體蛋白混合而產生最終的共軛體。如果載體蛋白先被激活，EDC方法則通過N－末端alpha－氨基，或者，如果序列中有賴氨酸的話，則可以通過賴氨酸的側鏈氨基與載體蛋白耦聯(lián)。m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide 酯(MBS)是一種雙性多肽耦聯(lián)試劑，可以將多肽與載體蛋白通過半胱氨酸耦聯(lián)。耦聯(lián)發(fā)生在半胱氨酸的硫醇基。如果多肽序列中不包括半胱氨酸，可以將一個半胱氨酸加到多肽的N-端或C-端，以獲得可控性更強的多肽與載體蛋白的耦聯(lián)。為了合成方便，我們建議將半胱氨酸加到多肽的N-末端。戊二醛是一種雙作用耦聯(lián)試劑，可以將兩個化合物通過氨基集團耦聯(lián)在一起。戊二醛能起到非常靈活的間隔多肽和載體蛋白的作用，時多肽能盡可能的暴露給免疫系統(tǒng)。但是，戊二醛是一種反應性很強的化合物，可以和Cys, Tyr及His等氨基酸發(fā)生一定程度的反應。反應后會形成結構很難預測的共軛體。因此，如果多肽序列末端只含有一個單一的自由氨基時，戊二醛方法非常有用。如果多肽含有多個自由氨基集團，會形成多聚合物，結構很難預測，盡管有很高的抗原性。
因為與BSA耦聯(lián)的多肽刺激產生的抗血清也含有針對BSA的抗體，一次可能導致假陽性結果。盡管KLH較大并有抗原行，但它在耦聯(lián)過程中可能會沉淀，因而有時候會很難處理。卵清蛋白（OVA）是另一種可以使用的載體蛋白。當要檢驗抗體只是針對多肽而不是針對載體蛋白時，OVA時用作第二載體的很好選擇。當要將抗體抗載體蛋白的反應降到最低時，可以使用兔血清白蛋白做載體。用RSA耦聯(lián)體免疫過的兔子不太可能產生針對載體的抗體，因為RSA是兔子自身的蛋白。如果注射動物不是兔子RSA則不會被認為是自體蛋白。
免疫系統(tǒng)是對多肽－載體蛋白整體發(fā)生反應的，即免疫反應有一部分是針對耦聯(lián)多肽，一部分是針對中間連接體，有一部分是針對載體蛋白。當用ELISA做篩選時建議使用不同載體蛋白耦聯(lián)的多肽聚合物。如果ELISA是在非耦聯(lián)多肽涂層的多孔板上做時則沒有必要這樣做。
3、多抗原位點多肽
MAP 體系代表著生成抗多肽抗體的另一種獨特方式。該體系基于一個小的無抗原性的多分枝賴氨酸核，在該賴氨酸核上同時并行合成了多個多肽。其結果是形成了一個三維大分子，因為它有很高的多肽抗原比例，因而不再需要使用載體蛋白來誘導抗體反應。每一個核分子可鏈接四個相同多肽。
理論上講，與耦聯(lián)到載體蛋白的單分子多肽相比，ＭＡＰ具有一定的優(yōu)勢，因為ＭＡＰ的賴氨酸核與多肽抗原相比顯得很小。這樣抗原的濃度就會達到最高。因而MAP體系具有很高的抗原性，與耦聯(lián)到載體蛋白的單分子多肽相比，具有很高的有效抗原濃度。有一點要指出的是，ＭＡＰ體系在合成是可能會有問題。賴氨酸核的多分枝性允許多拷貝多肽的合成，但如果合成的多肽較長，位阻(現(xiàn)象)會成為問題，導致該多聚體的有些肽鏈臂丟失氨基，成為缺失性產品。復合體的高分子量使質量控制措施（質譜或 分析性HPLC）很難實行。MAP的間接合成則解決了分析問題。間接合成時，多肽首先合成、純化，并作質譜或 HPLC分析。合成的多肽抗原再通過Cys鏈接到賴氨酸核上。
4、動物選擇
要生成好的抗體，必須選擇與抗原源差異較大的動物。要想獲得最大的免疫反應，絕對不能讓免疫動物對抗原產生‘自體識別’。例如，要想生成抗人體蛋白的抗體，使用兔或老鼠比使用猴子要好。對于非常保守的哺乳動物蛋白，使用鳥類動物（如雞）效果較好。
5、動物免疫
我們通常使用弗氏佐劑（Freund's）與抗原進行混合。第一次注射完全使用Freund's的免疫輔助劑。輔助劑與抗原聯(lián)合使用，可以提高免疫反應，從而用較少的疫苗可以產生較強的免疫反應。佐劑可以使抗原緩慢釋放，從而產生持續(xù)性刺激。注射方式為多位點的皮下注射。每只注射動物都要先收集免疫前血樣，以用于和以后的免疫血樣比較。所采集的血清樣本含有不同的免疫型和亞型。
6、抗體保存
存儲抗體溶液的最常見問題是細菌污染。加0.1％的疊氮化鈉保護劑則可以防止污染。如果您想長期保存血清，建議使用疊氮化鈉?？贵w血清應在－20度保存。抗體溶液不宜反復凍融，這樣易導致抗體失活。建議將血漿存儲在－20度的季銨氯化物中。在該溫度下抗體可以穩(wěn)定保存多年。消過毒的血清或儲存溫度為－70度時則不需要添加防腐劑。當保存時間較長時，抗體溶液會產生一種不溶性的脂類成分。該脂類成分可以通過離心去除。如果脂類成分在水面上形成薄膜，只需將水溶液部分取出，并按上述方法保存即可。加入疊氮化鈉保護劑的抗體溶液如果形成脂類薄膜并不表明細菌污染。當血清是用作細胞培養(yǎng)或體內研究時，則不能加疊氮化鈉。
7、抗體鑒定
檢測抗多肽反應是否發(fā)生的最簡單方法就是抗多肽ELISA。有兩種技術可以將多肽鏈接到ELISA板上。第一種方法就是直接將多肽鏈接到盤上。但如果鏈接氨基酸恰好是抗原決定簇的一部分，則抗體無法和多肽進一步鏈接，這樣產生假陰性結果的可能性增加。第二種方法則是先將多肽與載體蛋白耦合，然后將多肽－蛋白耦合體鏈接到ELISA盤上。這種鏈接方法會使抗體－多肽的結合成功率提高，因為多肽不是直接嵌入盤膜，因而會更加暴露給抗體。這種方法因而更可靠，可重復性更高。需要注意的是，用于該方法的載體蛋白必須不同于用于免疫耦合的載體蛋白。這樣會避免血清中抗載體蛋白反應所導致的高背景反應。
當做血清檢測時，另一點需要記住的是，由于免疫多肽與自然多肽結構上的差別，檢測時的抗多肽反應與試劑的抗多肽反應可能是不同的。任何檢測，尤其是測定滴定量以決定收獲點時，必須包括針對天然狀態(tài)下蛋白的檢測。當然可以做針對天然狀態(tài)下蛋白的ELISA；但由于血清在不同檢測體系中表現(xiàn)會不一樣，因此最好在血清被日常使用的體系中進行蛋白識別鑒定。如果血清將用于免疫沉淀反應，就應該進行針對該反應的檢測。
8、抗體純化
如抗血清使用過程中出現(xiàn)很高的背景，可使用幾種不同的方法對抗血清進行純化。非常重要的是首先必須確定背景是非特異性的，也就是說信號并非由抗血清對多肽的免疫反應造成的。多肽競爭是用來研究這一現(xiàn)象的很好的方法。
8.1 硫酸氨沉淀
硫酸氨沉淀是從溶液中分離蛋白質的常用方法。這是一種比較原始，非特異性分離技術，可以用來分離大部分膜蛋白，免疫球蛋白會殘留于溶液中。在溶液中，蛋白質會通過暴露于外的極性和離子基團同水分子形成氫鍵。加入象氨或硫酸根這樣的小分子可以使蛋白質失去結合的水分子，從而使蛋白質從溶液中沉淀出來。需要強調的是硫酸氨沉淀法難以得到高純度的抗體。其它大分子蛋白和混入絮狀沉淀中的蛋白會造成對抗體的污染。我們建議硫酸氨沉淀做為蛋白質純化的一步，并采用其它方法對得到的蛋白質進行進一步純化。
8.2 蛋白A/G結合法
A 蛋白或G蛋白對IgG 抗體Fc臂具有特異吸附，此特性可用于純化IgG抗體。蛋白A產于葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。它可以吸附兩個IgG分子。此吸附基于對Fc臂的特異性，不影響抗原吸附位點。G蛋白產于G型鏈球菌（Group G streptococci）, G蛋白以同A蛋百類似的方式吸附IgG抗體的Fc臂。對不同物種產生的IgG，A蛋白和G蛋白的吸附能力有一定的差別。選用方法前應對其吸附能力進行檢測。比如，G蛋白適合羊IgG，但A蛋白不具有此特性。A蛋白和G蛋白都沒有對雞IgG的吸附能力。從A蛋白和G蛋白柱上洗脫抗體時，須非常小心，以免抗體變性。
8.3 免疫親和純化法
免疫親和純化法是用于從原血清中分離抗原特異性抗體的最長用方法。同A蛋白和G蛋白不同，這種方法不能取得非特異性的Ig部分。在此方法中，多肽抗原首先共價結合于分離柱上的固定相。這樣，多抗樣品中對此多肽抗原有特異吸附的抗體將由于同抗原的吸附而留在分離柱上。未能結合的抗體將從分離柱上首先被洗脫，進一步洗脫將得到特異性抗體。用免疫親和純化法得到的抗體具有很高的特異性。使用此方法時，會由于洗脫條件的選擇，有時造成所分離抗體的失活。所以，比較提純后樣品同原血清的抗體活性非常重要。
常見問題
1．采集到的血清呈現(xiàn)紅色，是什么原因造成的？對使用有何影響？如何去除？
紅色是溶血造成的，也就是在血樣采集處理過程中紅細胞裂解，將血色素釋放到抗血清中。這在某些兔群中時有發(fā)生，尤其在較難放血的兔子中經常碰到。沒有理由擔心溶血會影響血清質量?？寡逯泻醒夭⒉粫绊懣寡宓奶匦?。并且任何紅細胞殘留物經過血清處理中的標準離心步驟后都會被去掉。如果需要，血色素可以通過以下方法去除：往血清中加入45％(NH4)2SO4，在4攝氏度下攪拌兩個小時。然后將溶液離心，將表面漂浮物去除。沉淀物可以在等量的水中再溶解，然后在所選的測試體系中進行同步檢測。如果抗多肽反應已經確定，則可以通過親和性純化將非特異性部分去除。
值得注意的是，將抗體從柱子上洗脫所需要的條件有可能會使抗體變性，從而導致對蛋白的親和性下降或消失。因此我們建議，在大規(guī)模純化血清前，可以先純化一個測試樣品。原始血清比純化的血清存儲時間要長的多?？梢栽谛枰臅r候純化一定的體積，這樣作對抗體的保存較為穩(wěn)妥。用于純化的親和柱一經制備后，可以儲存以備后用。要進行親和性純化需要將多肽連接到層析樹脂上。應該選擇什么樣的活化親和性樹脂呢？我們一般推薦使用NH2鏈接將多肽耦聯(lián)到樹脂柱上。這種鏈接最穩(wěn)定，可以選擇NHS 或 CNBr活化樹脂(Pharmacia Biotech)進行親和柱的抗體耦聯(lián)。
2．如何使用多肽親和性樹脂純化抗血清？
在4oC 將血清離心（2000xg），以去除任何顆?；蚣t細胞；利用PBS或TBS（pH7.4）將血清按1:1稀釋，每毫升親和樹脂施用5 毫升 血清，流速不能超過1 毫升/分鐘，在280nm下測試吸光度。將未結合的部分按2-5倍的比例重新過柱。在4oC時耦聯(lián)效率最高；收集未結合材料，利用濃縮裝置（>10kd）進行濃縮，以備測試；利用0.2M氨基乙酸（glycine）進行洗脫（pH1－2），在pH2.0時開始洗脫，在吸光度降到基線以下時收集洗脫液。將洗脫液的pH降低0.5-1，直到已沒有可檢測到的抗體從柱上洗下來；收集從純化柱上收集的各個部分，收集后通過加入1/10體積1 M Tris-HCl（pH=8.0） 或pH 8.0 的洗脫液將其中和；將純化的多肽進行ELISA分析，以決定具有最高親和性的洗液部分。將適當?shù)目贵w洗脫液濃縮至2-5mg/ml，混合50％甘油在－20oC下保存，或混合0.1% BSA在4oC下保存。加入0.01% NaN3作為防腐劑。
3．看起來有些渾濁的血清是否還可以使用？一般來講，這不會是問題。使用前可以用0.2mm的過濾器去除血清中的小顆粒。
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