經(jīng)驗(yàn)筆記：磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)原理、詳細(xì)步驟.....（值得收藏）
化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種測(cè)定方式。該技術(shù)的原理是利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì)釋放等能級(jí)的光子，對(duì)光子進(jìn)行測(cè)定而進(jìn)行定量分析?；瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。
化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用CLIA測(cè)定。CLIA起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代具備以下特點(diǎn) ：
①高度敏感，極限達(dá)10-17－10-19mol/L，遠(yuǎn)高于放射性免疫（RIA）、酶聯(lián)免疫（EIA）。與時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當(dāng)，但比TRFIA便宜。
②特異性強(qiáng)，重復(fù)性好CV＜10％。
③測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。
④試劑穩(wěn)定性好，無(wú)污染有效期12月。
⑤操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來(lái)的一種新興分析方法。該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動(dòng)化性，化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)了不可替代的作用。
目前磁微?；瘜W(xué)分析免疫分析已經(jīng)應(yīng)用于管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目以及電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目。
磁珠用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的方法：
一、間接法
間接法就是包被抗原，然后用酶標(biāo)記的抗抗體檢測(cè)樣本中抗體，適合于檢測(cè)對(duì)象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)較方便，只要變換包被抗原就可以檢測(cè)不同的項(xiàng)目。間接法的缺點(diǎn)：標(biāo)本中的特異性抗體會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗原，使結(jié)果出現(xiàn)假陰性。
操作步驟：
a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標(biāo)抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標(biāo)抗抗體孵育，清洗。
d)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。
二、捕獲法
血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定，因此測(cè)定IgM抗體多用捕獲法。先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測(cè)定特異性IgM。
操作步驟：
a)將抗人IgM抗體連接在磁性固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標(biāo)本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合洗滌。
d)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合洗滌。
e)加底物顯色，檢測(cè)信號(hào)。
三、固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法
競(jìng)爭(zhēng)法，是指受檢抗體和酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)性的與磁珠表面抗原結(jié)合。結(jié)合于固相載體的酶標(biāo)抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無(wú)抗體，酶標(biāo)抗體能夠順利與抗原結(jié)合，出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。若受檢樣本中有抗體，則競(jìng)爭(zhēng)性的占去了酶標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合，酶標(biāo)抗體的結(jié)合力減弱，信號(hào)強(qiáng)度減弱。
操作步驟：
a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原的混合液孵育。
c)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。
四、雙抗夾心（兩步法）
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法。
操作步驟：
a)將特異性抗體與磁性固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
b)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)問(wèn)，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
c)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。
d)加發(fā)光底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
五、雙抗夾心法（一步法）
在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hook effect），類(lèi)同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，當(dāng)樣本中抗原量較多是，容易出現(xiàn)假陰性。
操作步驟：
a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標(biāo)二抗孵育，清洗。
c)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。
化學(xué)發(fā)光用磁微粒 http://www.5000js.com/M/Product/purmaghomo/
- 上一篇：武漢大學(xué)采用我司鏈霉親和素磁珠在《Nucleic Acids 2022/9/19
- 下一篇：東南大學(xué)采用我司蛋白G磁珠偶聯(lián)抗體捕獲細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)表論文 2022/6/4