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1．蛋白不掛磁珠

蛋白不掛磁珠說白了就是蛋白和磁珠的結(jié)合能力不足導(dǎo)致的。根據(jù)影響結(jié)合能力的因素，可按照以下思路來排查原因。

1）His標(biāo)簽還在嗎？大腸桿菌表達(dá)外源蛋白過程中，有時候會出現(xiàn)序列丟失的現(xiàn)象，若是標(biāo)簽丟失，蛋白自然無法掛柱了。那么檢測方法也很簡單，找個 His抗體通過 Western-Blot 檢測下立馬知道結(jié)果了。

2）標(biāo)簽表達(dá)以后暴露在蛋白表面嗎？在蛋白中加入適量的尿素或者鹽酸胍等變性劑看下蛋白能不能掛磁珠，若此時可以掛磁珠，說明蛋白表達(dá)過程中His標(biāo)簽可能暴露不充分。這個時候，可以嘗試在變性劑存在條件下純化，若不能接受變性條件純化，只能嘗試上游修改了，要么增加 His 標(biāo)簽長度，增加暴露在外面的His個數(shù)，要么修改 His 添加的位置。

3） 選擇了什么金屬離子？如果選擇的是 Ni²⁺或者 Co²⁺，換成作用力更強的 Cu²⁺或者 Zn²⁺可能可以解決問題。

4）緩沖液條件對嗎？如果發(fā)現(xiàn)緩沖液中竟然出現(xiàn)了EDTA等鰲合劑，必須要去掉哦。此外適當(dāng)提高緩沖液pH、降低緩沖液中的咪唑濃度、調(diào)整緩沖液中的鹽濃度或者更換成磷酸緩沖液都可能提高 His 標(biāo)簽蛋白的掛磁珠能力。

5） 接觸時間夠嗎？適當(dāng)嘗試延長接觸時間，可能提高掛磁珠能力。

2．蛋白結(jié)合磁珠后洗脫不下來

蛋白無法掛磁珠是結(jié)合能力不足導(dǎo)致的，那么掛磁珠后洗不下來自然是因為洗脫條件太溫和不至于破壞較強的作用力造成的。因此可從以下角度思考解決：

1） 洗脫強度不夠？增加洗脫的咪唑濃度或者降低 pH 進行更加劇烈的洗脫。

2） 蛋白和磁珠有其他非特異的吸附？洗脫緩沖液中加入去垢劑（0.2% 的 TritionX-100）進行洗脫。

3） 改變緩沖液條件：降低緩沖液的pH、提高咪唑濃度、調(diào)整鹽濃度或者換成Tris-HCl緩沖液有可能都能幫到忙。當(dāng)然，EDTA這些鰲合劑因為直接和金屬離子作用還是不要添加了。

4）減少接觸時間：結(jié)合能力已經(jīng)這么強了，適當(dāng)減少接觸時間加速試驗是個不錯的選擇。

5）更換金屬離子：如果現(xiàn)在用的是 Ni²⁺，換成 Co²⁺離子可能可以解決問題。

6） 上述都不行的話，只能回頭重新進行載體構(gòu)建了，嘗試減少添加的 His 數(shù)目了。

3． 蛋白純度不夠

從His標(biāo)簽純化的原理我們知道，只要蛋白中有His和金屬離子都有一定的結(jié)合能力，所以根據(jù)樣品中雜質(zhì)蛋白的不同，純化得到的蛋白純度一定會有差異的。我們能做的是盡量提高目的蛋白的純度：

1）優(yōu)化金屬離子：純度不夠主要原因是宿主蛋白中一些含有His的天然蛋白結(jié)合在了磁珠上，那么我們可以通過更換成結(jié)合能力較弱的Co²⁺離子，使得含有His的雜蛋白無法結(jié)合，而標(biāo)簽蛋白可以結(jié)合，從而提高最終得到的蛋白的純度。

2） 優(yōu)化結(jié)合洗脫條件：找最適合的結(jié)合洗脫條件，將標(biāo)簽蛋白和雜蛋白盡可能分開。

3）雙標(biāo)簽純化：Strep II也是一個長度較小（8個氨基酸）的標(biāo)簽，可以在重組蛋白上同時添加His標(biāo)簽合Strep II標(biāo)簽，通過兩步親和分離，必能提高目的蛋白純度。

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