qPCR檢測中極低濃度樣本取樣和隨機誤差對結(jié)果的影響分析
背景介紹
無論在化學(xué)檢驗還是醫(yī)學(xué)檢驗中，極低濃度樣本檢測均極為困難，檢測精度的進(jìn)步是隨著人類對少量、微量、痕量物質(zhì)檢測的要求而一步步提升起來的?；氐结t(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，被測物質(zhì)的低值檢測能力一直是衡量產(chǎn)品質(zhì)量的一個最關(guān)鍵的指標(biāo)，但在信號放大和檢測方法沒有革命性改變的情況下，極低濃度樣本的測定是否存在一個偏差上限呢？如果僅僅考慮取樣隨機誤差，結(jié)果會受多大的影響？本文將試圖通過建設(shè)一個取樣模型進(jìn)行分析，歡迎業(yè)內(nèi)專家們批評指正，拋磚引玉歡迎大家提出更多更符合實際情況的取樣模型。
實驗過程
假設(shè)現(xiàn)采用qPCR檢測試劑盒對已明確定值為50IU/ml乙型肝炎病毒血清樣本進(jìn)行定量測定，取血清樣200μl，核酸提取富集為50μl，其中20μl用做模板上機進(jìn)行測定，最終根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出濃度值；
20個重復(fù)記為一組，對濃度值取對數(shù)后計算均值、CV；
注意，因?qū)嶒災(zāi)Ｐ驮O(shè)置僅考慮取樣誤差，固認(rèn)為實驗過程完美，不考慮以下可能性誤差：
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操作過程
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樣本濃度偏差
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DNA在樣本中均勻分布，不考慮泊松分布情況
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各品牌對病毒核酸IU單位和拷貝單位的換算關(guān)系差異
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IU與拷貝換算關(guān)系定為1:1
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試劑儲存及使用
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標(biāo)準(zhǔn)品制備
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核酸提取損耗
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加樣體積準(zhǔn)確性
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核酸擴增效率
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熒光閾值調(diào)整
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標(biāo)品定值曲線擬合度
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其他可能引起結(jié)果定值偏差的情況
取樣模型
前提：
濃度為50IU/ml的血清準(zhǔn)確量取200μl，其中包含的DNA拷貝數(shù)量為10；
提取富集后的核酸溶液體積為50μl；
取樣體積20μl；
取樣模型描述：
假設(shè)將提取富集后的核酸溶液分割為1000個箱子（編號為1,2,3,……,1000）；
其中編號為100倍數(shù)的箱子內(nèi)包含DNA片段（編號為100,200,300,……，1000）；
從1000個箱子中隨機抽樣400份，記錄箱子編號，統(tǒng)計編號為100倍數(shù)的箱子數(shù)量（即為抽到的DNA數(shù)量，期望值為4，對應(yīng)濃度值為50IU/ml，取對數(shù)為1.69897）；
隨機取樣20次，得到20次抽取DNA數(shù)量的記錄，計算得到一組濃度對數(shù)均值和CV；
如取樣中未取到DNA，則對剩余的有效記錄計算均值和CV；
數(shù)據(jù)結(jié)果及分析：
計算獲得1萬組數(shù)據(jù)，將濃度對數(shù)均值和CV從大到小按照等距分為100組，用柱形圖對濃度對數(shù)均值和CV頻次進(jìn)行分析。
綜上，僅考慮取樣時的隨機誤差時，濃度50IU/ml樣本實驗結(jié)果統(tǒng)計如下：
同等條件下，如果樣本更換為100IU/ml，隨機抽樣結(jié)果如下：
結(jié)論：
隨著方法學(xué)的不斷成熟，很多以前不能檢測的微量甚至痕量樣本都可以進(jìn)行測定，但每種方法學(xué)都有自己的檢測閾值下限，理論上是不可能突破方法學(xué)和實際操作流程限制來人為拔高檢測精度的。
隨機抽樣和筆者實際實驗表明用qPCR方法對極低值樣本(≤100IU/ml)進(jìn)行檢測定值是個極為困難的事情，實驗CV能控制在5%以內(nèi)幾乎不可能。不知道其他實驗室或研發(fā)人員是否有精度控制的獨門絕招可以大幅降低實驗偏差。
我們希望能看到更多更好的產(chǎn)品出現(xiàn)，客觀公正得對產(chǎn)品進(jìn)行性能評估，也希望有更劃時代的方法學(xué)出現(xiàn)，讓我們的醫(yī)學(xué)檢測更加精準(zhǔn)，為患者的早篩查、早診斷、早治療做出貢獻(xiàn)。
參考資料:
核酸擴增法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則
YY/T 1182-2010核酸擴增檢測用試劑(盒)
關(guān)于HBV-DNA及HBsAg定量單位IU/ml、copies/ml和ng/ml之間的換算問題
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