時間分辨熒光免疫層析定量檢測技術(shù)介紹
來源：生物磁珠專家 2020-9-15 17:41:01??????點擊：
一、稀土元素發(fā)光特點
1、Stokes位移大
Stokes位移達(dá)200nm,很容易分辨激發(fā)光和發(fā)射光，從而排除激發(fā)光干擾。而普通熒光物質(zhì)熒光光譜的Stokes位移只有幾十納米，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜通常有部分重疊，互相干擾嚴(yán)重；
2、衰變時間長
鑭系元素與普通的熒光團(tuán)比較，鑭系元素離子螯合物熒光的衰變時間（decay time）長（10～2000us），為傳統(tǒng)熒光的103～106倍。通過時間分辨，可極大地降低了本底熒光,實現(xiàn)了高信噪比；
3、激發(fā)光譜寬而發(fā)射光譜窄
鑭系螯合物激發(fā)光光譜較寬，最大激發(fā)波長在300～500nm，可通過增加激發(fā)光能量來提高靈敏度。而發(fā)射光譜帶很窄，甚至不到10nm，可采用只允許發(fā)射熒光通過的濾光片，進(jìn)一步降低本底熒光，狹窄的發(fā)射波段為多次分析成為可能。
三、時間分辨熒光免疫層析（TRFILF）原理
當(dāng)將含有待測抗原（抗體）的樣品滴在加樣區(qū)，待測樣品中的抗原（抗體）與結(jié)合墊中的熒光納米微球標(biāo)記的抗體（抗原）結(jié)合并通過毛細(xì)作用向前層析，當(dāng)達(dá)到檢測區(qū)后，與檢測線上固定的抗體（抗原）結(jié)合，形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測線上，而多余的熒光微球標(biāo)記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線二抗結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，用紫外光源（340nm）對檢測區(qū)掃描檢測，檢測線和質(zhì)控線上熒光納米微球發(fā)出高強(qiáng)度的熒光（615nm），且衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光，這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱及其比值，即可分析出樣品中待測物的濃度。
四、時間分辨熒光免疫層析優(yōu)勢
1）靈敏度高，比金標(biāo)、普通熒光靈敏度高2-3個數(shù)量級；
2）可定量檢測，根據(jù)內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可給出待測物的具體濃度；
3）標(biāo)記物穩(wěn)定，抗干擾強(qiáng)，檢測結(jié)果重復(fù)性好；
4）操作簡便，檢測時間短，可用于現(xiàn)場篩查；
5）成本便宜，性價比高；
1、Stokes位移大
Stokes位移達(dá)200nm,很容易分辨激發(fā)光和發(fā)射光，從而排除激發(fā)光干擾。而普通熒光物質(zhì)熒光光譜的Stokes位移只有幾十納米，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜通常有部分重疊，互相干擾嚴(yán)重；
2、衰變時間長
鑭系元素與普通的熒光團(tuán)比較，鑭系元素離子螯合物熒光的衰變時間（decay time）長（10～2000us），為傳統(tǒng)熒光的103～106倍。通過時間分辨，可極大地降低了本底熒光,實現(xiàn)了高信噪比；
3、激發(fā)光譜寬而發(fā)射光譜窄
鑭系螯合物激發(fā)光光譜較寬，最大激發(fā)波長在300～500nm，可通過增加激發(fā)光能量來提高靈敏度。而發(fā)射光譜帶很窄，甚至不到10nm，可采用只允許發(fā)射熒光通過的濾光片，進(jìn)一步降低本底熒光，狹窄的發(fā)射波段為多次分析成為可能。
二、熒光納米微球
與經(jīng)典的時間分辨熒光免疫分析方法DELFIA法不同，時間分辨熒光免疫層析技術(shù)采用熒光納米微球作為標(biāo)記物，每個微球中可包裹成千上萬個熒光分子，大大提高了標(biāo)記效率，有效的提高了靈敏度；同時納米熒光微球表面修飾有合適密度的羧基，用于與蛋白或抗體的共價偶聯(lián)，提高標(biāo)記物的穩(wěn)定性。三、時間分辨熒光免疫層析（TRFILF）原理
當(dāng)將含有待測抗原（抗體）的樣品滴在加樣區(qū)，待測樣品中的抗原（抗體）與結(jié)合墊中的熒光納米微球標(biāo)記的抗體（抗原）結(jié)合并通過毛細(xì)作用向前層析，當(dāng)達(dá)到檢測區(qū)后，與檢測線上固定的抗體（抗原）結(jié)合，形成微粒-抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物并被固定在檢測線上，而多余的熒光微球標(biāo)記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線二抗結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，用紫外光源（340nm）對檢測區(qū)掃描檢測，檢測線和質(zhì)控線上熒光納米微球發(fā)出高強(qiáng)度的熒光（615nm），且衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光，這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱及其比值，即可分析出樣品中待測物的濃度。
四、時間分辨熒光免疫層析優(yōu)勢
1）靈敏度高，比金標(biāo)、普通熒光靈敏度高2-3個數(shù)量級；
2）可定量檢測，根據(jù)內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可給出待測物的具體濃度；
3）標(biāo)記物穩(wěn)定，抗干擾強(qiáng)，檢測結(jié)果重復(fù)性好；
4）操作簡便，檢測時間短，可用于現(xiàn)場篩查；
5）成本便宜，性價比高；
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