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       蛋白是基因功能的執(zhí)行者，是基因發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。不同蛋白質(zhì)之間通過蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）形成互作網(wǎng)絡(luò)參與生物信號傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過程。深入解析PPI網(wǎng)絡(luò)對揭示蛋白質(zhì)在生物過程中的功能，闡明疾病等特殊生理狀態(tài)下生物信號和能量物質(zhì)代謝的反應(yīng)機(jī)制具有重要意義。今天將為大家分享生物研究中常用蛋白質(zhì)互作檢測技術(shù)和方法，與大家共同學(xué)習(xí)耳熟能詳?shù)?/span>免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）及相關(guān)的免疫沉淀-質(zhì)譜技術(shù)（Co-IP-MS），歡迎點(diǎn)贊關(guān)注，多多交流指正。

       免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的特性，利用抗體將目的蛋白從復(fù)雜樣本中富集出來的一種生物學(xué)手段。由此衍生出來的免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation，Co-IP）則是基于IP的原理，研究蛋白質(zhì)相互作用的一種手段，能夠有效確定兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的生理性相互作用，是蛋白互作檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

一. Co-IP實(shí)驗(yàn)的主要原理

Co-IP實(shí)驗(yàn)的主要原理是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的特性，將特異性抗體加入到含有目的蛋白樣本溶液中，抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。Protein A/G融合Protein A和Protein B的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能與抗體的Fc片段特異性結(jié)合，因此利用固定在磁珠上的Protein A/G可以與目的蛋白-抗體復(fù)合物結(jié)合形成復(fù)合體。最終通過離心或磁分離、收集、洗脫、溶解等步驟獲得目的蛋白以及與目的蛋白互作的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)從復(fù)雜樣本中富集目的蛋白及相關(guān)互作蛋白。

免疫沉淀原理示意圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

二. Co-IP的技術(shù)特點(diǎn)

1. 技術(shù)優(yōu)勢

       體內(nèi)天然狀態(tài)下驗(yàn)證互作，接近正常生理水平；蛋白處理細(xì)胞生理環(huán)境下，避免人為干擾；分離天然狀態(tài)下的蛋白進(jìn)行功能檢測。

2. 技術(shù)不足

       無法檢測弱相互作用和瞬時相互作用；檢測直接相互作用，對于間接相互作用檢測效果差；對抗體要求高。

三. Co-IP的實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、蛋白裂解液選擇

為避免破壞蛋白相互作用，Co-IP實(shí)驗(yàn)對蛋白裂解液具有一定要求：

（1）使用非變性溫和裂解液；

（2）使用溫和的非離子去垢劑如NP-40，Triton X-100，避免使用SDS等離子型去垢劑。

2、抗體選擇

（1）選擇經(jīng)過IP驗(yàn)證的抗體，從而識別目的蛋白天然構(gòu)象；

（2）若無合適的IP級別抗體，則可添加標(biāo)簽蛋白，使用IP級別的標(biāo)簽抗體進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)；

3、固相支持物選擇

Co-IP實(shí)驗(yàn)常用固相支持物主要有瓊脂糖珠和磁珠兩種（具體請參考網(wǎng)頁http://www.5000js.com/Product/0293713052.html），二者主要區(qū)別為：

4、洗脫方式

不同洗脫液對于蛋白構(gòu)象和相互作用影響較大，Co-IP實(shí)驗(yàn)需根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求選擇不同洗脫方式：

（1）非變性洗脫：通常使用低pH洗脫液進(jìn)行洗脫（如pH 2.5-3.0的0.1 M甘氨酸溶液），此類洗脫方式能夠保留蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，便于蛋白的功能驗(yàn)證如酶活檢測；

（2）變性洗脫：通常使用蛋白上樣緩沖液進(jìn)行洗脫，此類洗脫方式會破壞蛋白結(jié)構(gòu)，通常用于互作蛋白鑒定如Western blot。

四. Co-IP的實(shí)驗(yàn)流程

1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求對培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行相應(yīng)處理（如細(xì)胞轉(zhuǎn)染、藥物處理等）；

注意：若是組織樣本，則對組織破碎后直接跳轉(zhuǎn)到步驟3。

2、收集處理后的細(xì)胞并吸棄培養(yǎng)基，刮下細(xì)胞并收集于1.5 mL離心管中，4 ℃, 1000 rpm條件下離心5 min，棄上清；

3、使用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，4 ℃, 500 g條件下離心5 min，棄上清；

注意：

（1）IP實(shí)驗(yàn)流程需在冰上進(jìn)行，避免蛋白出現(xiàn)降解；

（2）實(shí)驗(yàn)中的試劑使用前需在4 ℃預(yù)冷處理；

4、加入500 μL含蛋白酶/磷酸酶抑制劑的IP裂解液，輕輕吹打混勻后置于冰上裂解細(xì)胞30 min；

注意：

（1）IP裂解液根據(jù)樣本量使用，避免裂解不徹底或者目的蛋白濃度過低；

（2）保證加入蛋白酶/磷酸酶抑制劑，避免目的蛋白降解；

（3）保證裂解時間充足，避免裂解不徹底；

（4）裂解時可將樣本置于搖床，增加裂解液與樣本接觸面積；

5、裂解完成后，4 ℃，12000 rpm條件下離心30 min，取上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中；

6、預(yù)留20 μL上清液作為WB的Input樣本，剩余上清中加入適量抗體，輕輕吹打混勻后4 ℃翻轉(zhuǎn)搖床孵育過夜或常溫翻轉(zhuǎn)孵育2 h；

注意：

（1）需使用IP級別抗體，最好為單抗，避免非特異性結(jié)合；

（2）建議4 ℃翻轉(zhuǎn)孵育過夜，低溫有助于降低非特異性結(jié)合；

（3）抗體按照說明書確定用量，避免用量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合；

（4）可將上清溶液分為兩份，一份加入特異性抗體作為IP組，另一份加入與特異性抗體同源的IgG抗體作為陰性對照組（IgG組）

7、取適量Protein A/G beads并利用IP裂解液清洗3遍；

注意：

（1）儲存珠子的液體與IP實(shí)驗(yàn)不兼容，使用時需對beads進(jìn)行清洗；

（2）取珠子時可將槍頭稍微剪成適當(dāng)大小斜口，避免珠子堵塞槍頭或者槍頭破壞珠子；

（3）磁珠和瓊脂糖珠與抗體結(jié)合條件不同，需根據(jù)珠子類型選擇合適孵育時間；磁珠常溫下旋轉(zhuǎn)孵育20 min即可，瓊脂糖珠則通常在4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育1-4 h；

8、將清洗后的Protein A/G beads（以瓊脂糖珠為例）加入抗體孵育完成后的溶液中，4 ℃翻轉(zhuǎn)搖床孵育1-4 h；

注意：

（1）需保證足量的beads，避免beads用量不足以結(jié)合抗體-目的蛋白復(fù)合物；

（2）beads孵育時間可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整，避免因孵育時間過短或過長導(dǎo)致富集效果差或者非特異性結(jié)合；

9、Protein A/G beads孵育完成后，4 ℃，2000 rpm條件下離心5 min，收集beads；

10、加入1 mL IP裂解液，輕柔顛倒混勻后置于冰上靜置2-3 min洗滌protein A/G-beads，4 ℃，2000 rpm條件下離心5 min，收集beads；

12、重復(fù)步驟10，洗滌beads 10次；

注意：

（1）步驟9-12需輕柔進(jìn)行，避免破壞beads-抗體-目的蛋白復(fù)合體；

（2）清洗次數(shù)會影響最終結(jié)果，清洗次數(shù)過多會導(dǎo)致弱結(jié)合蛋白被洗脫，檢測信號弱；清洗次數(shù)過低會導(dǎo)致非特異性結(jié)合未被清洗干凈，信噪比高；

13、根據(jù)檢測方法選擇合適的洗脫方法對beads上的蛋白進(jìn)行洗脫，最終獲得目的蛋白；

注意：

（1）抗體和beads為非共價(jià)結(jié)合，會一同被洗脫；

（2）Western blot實(shí)驗(yàn)通常使用3×蛋白上樣緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫效率高，可同時對蛋白變性處理，便于后續(xù)檢測；

（3）若進(jìn)行其他檢測如酶活性檢測，則需使用兼容下游實(shí)驗(yàn)的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫；

14、利用Western blot或者質(zhì)譜分析的方法對目的蛋白進(jìn)行檢測；

IP實(shí)驗(yàn)流程示意圖

五. Co-IP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀

1、已知蛋白互作驗(yàn)證（內(nèi)源蛋白）

對于已知蛋白是否存在相互作用，通常利用Western blot進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)通常包含Input樣本、IgG樣本以及IP樣本，其中Input樣本和IgG樣本分別可作為陽性對照和陰性對照，IP樣本則用于檢測蛋白是否存在互作。

Input組：陽性對照組，抗體富集前預(yù)留樣本，檢測蛋白A和B的表達(dá)情況；

IgG組：陰性對照組，無條帶，用于排除IP組出現(xiàn)非特異性條帶；

IP組：實(shí)驗(yàn)組，用于檢測蛋白A和蛋白B是否存在互作。

上圖檢測內(nèi)源蛋白A和蛋白B是否互作。Input組蛋白A和蛋白B均正常檢出目的條帶，表明蛋白A和蛋白B表達(dá)正常，抗體有效；IgG組未檢出條帶，表明抗體無非特異結(jié)合；利用蛋白A的抗體進(jìn)行IP富集，蛋白A表達(dá)較Input組明顯增多，表明對蛋白A富集成功。圖（左）中蛋白B檢出條帶，證明用抗體A富集后的樣本中包含蛋白B，蛋白A和蛋白B存在相互作用。圖（右）中蛋白B未檢出條帶，證明用抗體A富集后的樣本中不包含蛋白B，蛋白A和蛋白B不存在相互作用。

注意：Co-IP實(shí)驗(yàn)通常進(jìn)行正拉（抗體A富集檢測蛋白B）和反拉（抗體B富集檢測蛋白A）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行互作檢測，兩次結(jié)果結(jié)尾陽性時證實(shí)蛋白A和蛋白B存在相互作用。

2、已知蛋白互作驗(yàn)證（外源質(zhì)粒高表達(dá)）

對于轉(zhuǎn)染基因表達(dá)質(zhì)粒時，樣本通常分為3組，Protein A、Protein B以及Protein A+ Protein B，可使用IgG作為陰性對照，對于目的蛋白無IP級別抗體時可使用標(biāo)簽抗體進(jìn)行相關(guān)檢測。

上圖為分別轉(zhuǎn)染基因A和基因B表達(dá)質(zhì)粒后分析蛋白A和蛋白B是否互作。圖中Input結(jié)果內(nèi)參蛋白GAPDH均檢出條帶，表明蛋白提取過程正常，蛋白A和蛋白B均檢測目的條帶，表明質(zhì)粒正常表達(dá)；圖（左）中，利用蛋白A的抗體進(jìn)行富集，蛋白A組和Protein A + Protein B組中均可檢出蛋白A條帶，表明蛋白A抗體IP富集成功，Protein A + Protein B組中檢測蛋白B條帶，證明用抗體A富集后的樣本中包含蛋白B，蛋白A和蛋白B存在相互作用。圖（右）Protein A + Protein B組中未檢出蛋白B條帶，證明用蛋白抗體A富集后的樣本中不包含蛋白B，蛋白A和蛋白B不存在相互作用。

3、未知互作蛋白篩選

對于篩選與目的蛋白存在相互作用的潛在蛋白，通常利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分析。首先利用Western blot技術(shù)對IP結(jié)果進(jìn)行檢測，確認(rèn)抗體成功富集目的蛋白后對樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析。Western blot檢測包含Input樣本、IgG樣本以及IP樣本，其中Input樣本和IgG樣本分別可作為陽性對照和陰性對照，IP樣本則用于檢測蛋白富集效果；質(zhì)譜分析時可將IgG樣本作為陰性對照，排除假陽性信號。

如上圖所示，Input組蛋白A正常檢出目的條帶，表明蛋白A表達(dá)正常，抗體有效；IgG組未檢出條帶，表明抗體無非特異結(jié)合；利用蛋白A的抗體進(jìn)行IP富集，蛋白A表達(dá)較Input組明顯增多，表明對蛋白A富集成功。隨后對IP富集后的beads進(jìn)行蛋白洗脫后質(zhì)譜鑒定除Protein B、Protein C等，后續(xù)可通過Co-IP對感興趣的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步互作驗(yàn)證。

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六. Co-IP的實(shí)驗(yàn)問題與分析

1、Co-IP結(jié)果無信號

原因1：目的蛋白表達(dá)低，或者IP富集效果差

根據(jù)Input組和IP組目的蛋白檢測結(jié)果分析原因，酌情考慮使用外源表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行目的基因高表達(dá)或者加大用于IP富集的蛋白裂解物。

原因2：蛋白互作程度低

使用外源質(zhì)粒對互作蛋白高表達(dá)，增加蛋白裂解樣的使用，或者使用適當(dāng)手段誘導(dǎo)互作。

原因3：裂解液使用不當(dāng)

變性裂解液會破壞蛋白相互作用，建議使用溫和型非變性裂解液處理樣本，操作過程中盡量輕柔，避免破壞蛋白相互作用。

原因4：抗體使用不足或者效用差

通過根據(jù)Input結(jié)果分析抗體效用，若抗體工作效果較好，則可增加IP過程中抗體用量。

原因5：beads與抗體結(jié)合效果差

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇適合的瓊脂糖珠或者磁珠，并且使用beads前檢測beads是否保存不當(dāng)導(dǎo)致過期或者失效。

2、Co-IP結(jié)果雜帶多，背景干擾嚴(yán)重

原因1：beads結(jié)合后洗滌次數(shù)不足，清洗不徹底

增加洗滌次數(shù)，適當(dāng)梯度增加洗滌液中NaCl和去垢劑的濃度。

原因2：抗體特異性差或者IP富集時抗體濃度過高

分析Input組條帶信號，根據(jù)Input結(jié)果考慮降低IP富集時抗體使用濃度或者更換抗體。

原因3：IP富集時樣本用量過多或者實(shí)驗(yàn)過程中蛋白降解

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)減少細(xì)胞裂解樣本量，并且保證實(shí)驗(yàn)過程在冰上進(jìn)行，裂解液中加入足量蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。

原因4：洗脫后的WB檢測實(shí)驗(yàn)過程中操作不規(guī)范

嚴(yán)格按照WB實(shí)驗(yàn)流程，注意轉(zhuǎn)膜時間、膜封閉條件、一抗和二抗稀釋比例、孵育時間等，一抗孵育建議4℃過夜進(jìn)行，低溫有助于降低非特異性結(jié)合。

原因5：抗體重鏈或者輕鏈干擾

IP實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)非特異性條帶位置位于55 kDa附近或者25 kDa附件時可考慮IgG重鏈或者輕鏈的干擾。對于此類情況，盡量在IP富集與WB檢測時選擇不同種屬來源的抗體（例如IP抗體為兔抗，WB抗體則選擇鼠抗）。

3、IgG組中檢出非特異性條帶

原因1：IgG與非特異性抗體結(jié)合

若IgG組中檢出非特異性條帶，可適當(dāng)增加beads清洗次數(shù)以及洗滌液中NaCl和去垢劑的濃度；或者適當(dāng)降低抗體使用濃度；

原因2：IgG抗體自身問題

更換陰性對照的IgG抗體，或者在IP富集與WB檢測時選擇不同種屬來源的抗體。

七. Co-IP技術(shù)應(yīng)用案例

1、驗(yàn)證蛋白-蛋白相互作用

Co-IP檢測內(nèi)源性STX11和SNAP25蛋白相互作用。Input組檢出STX11和SNAP25目的蛋白，表明抗體工作正常；利用STX11抗體IP富集后檢出SNAP25蛋白，SNAP25抗體IP富集后同樣檢出STX11蛋白，表明STX11與SNAP25存在相互作用。

2、蛋白修飾研究

利用Co-IP檢測泛素E3連接酶STUB1對UHRF1的泛素化修飾作用。圖A中，Input結(jié)果顯示GAPDH和Flag-UHRF1表達(dá)正常，HA-STUB1隨加入量表達(dá)逐漸升高；IP：Flag結(jié)果顯示，利用Flag抗體進(jìn)行IP富集后，F(xiàn)lag-UHRF1正常檢出，表明IP富集正常，Myc-Ub檢出，且條帶隨STUB1加入量增加而逐漸升高，表明UHRF1與E3連接酶SUTB1相互作用被泛素化修飾。圖B中，干擾STUB1的表達(dá)，導(dǎo)致IP：Flag組中Myc-Ub條帶減弱，表明STUB1的敲低抑制UHRF1的泛素化修飾。PS：Myc-Ub是泛素分子，在進(jìn)行泛素化修飾實(shí)驗(yàn)中提供所需的泛素分子。

3、篩選疾病標(biāo)志物

研究人員通過使用源自細(xì)胞裂解物的抗原庫，對系統(tǒng)性硬化癥（SSc）患者或健康供體的血清利用磁珠進(jìn)行IP富集。富集的抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜（MS）分析鑒定，并對候選差異抗體在兩組獨(dú)立的SSc患者中進(jìn)行正交驗(yàn)證，結(jié)果顯示顯示SSc患者的抗PRMT5抗體顯著升高。并且候選差異抗體在區(qū)分SSc與健康對照和其他自身免疫性疾?。òㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡和干燥綜合征）方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的診斷準(zhǔn)確性，曲線下面積范圍為0.900至0.988。結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)最終證實(shí)抗PRMT5抗體在SSc中的潛在關(guān)鍵作用。

4、篩選下游互作蛋白或藥物靶點(diǎn)

為了鑒定SERPINE2相關(guān)蛋白并探索SERPINE2在肝癌轉(zhuǎn)移中的潛在分子機(jī)制，研究人員利用SERPINE2抗體進(jìn)行IP富集后，以IgG抗體作為陰性對照，通過質(zhì)譜分析與SERPINE2存在互作的潛在蛋白，并結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)確定了7種潛在的SERPINE2相互作用蛋白，并通過Co-IP證實(shí)SERPINE2與EGFR存在相互作用。廈門普睿邁格生物科技有限公司提供各類磁珠http://www.5000js.com/Product/，用于化學(xué)生物學(xué)研究。