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第二節(jié)        基因組DNA的分離與純化

一、分離與純化的方法

雙鏈DNA因固有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，是一種惰性很強(qiáng)的化學(xué)分子，可用于重現(xiàn)犯罪現(xiàn)場(chǎng)和進(jìn)行古生物學(xué)分析。但由于是很長的線性分子（如人的染色體DNA平均長度為100～150Mb）而且缺乏橫向的穩(wěn)定性，因此很容易斷裂。在溶液中，由于堿基堆砌力的相互作用與磷酸基團(tuán)的靜電排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很難溶解，而且也增加了它對(duì)剪切力的敏感性。即便是最輕柔的方式，高分子量的DNA也很容易因剪切力發(fā)生橫向的斷裂。常規(guī)方法分離基因組DNA時(shí)，大于150kb的DNA分子很容易發(fā)生斷裂。

（一）酚抽提法

本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過改進(jìn)，以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要行透析或沉淀處理，獲得所需的DNA樣品。

其中，EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可以抑制DNA酶的活性，同時(shí)降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；SDS為生物陰離子去垢劑，主要引起細(xì)胞膜的降解并能乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，與這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合可以使它們沉淀，其非極性端與膜磷脂結(jié)合，極性端使蛋白質(zhì)變性、解聚，所以SDS同時(shí)還有降解DNA酶的作用；無DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K則有水解蛋白質(zhì)的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白質(zhì)，也有裂解細(xì)胞的作用；酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保證抽提后DNA進(jìn)入水相，而避免滯留于蛋白質(zhì)層。

多次抽提可提高DNA的純度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀處理。透析處理能減少對(duì)DNA的剪切效應(yīng)，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀處理常以醋酸銨為鹽類，用2倍體積的無水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗滌，最后得到的DNA大小在100kb～150kb。

運(yùn)用該法可以從單層或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織及血液標(biāo)本中制備少于10mg至大到數(shù)百mg的DNA樣品。由于分離純化的每一步都有剪切力的影響，最后得到的DNA樣品中分子量超過100kb～150kb的很少，但這種大小的DNA足以作為PCR反應(yīng)的模板和進(jìn)行Southern blotting分析以及構(gòu)建以λ噬菌體為載體的基因組DNA文庫。從5×10⁷個(gè)培養(yǎng)的非整倍體哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞）大約可以制備分子量在100kb～150kb的DNA 200mg，自20ml血液可得250mg。

（二）甲酰胺解聚法

為構(gòu)建高容量載體的DNA文庫和進(jìn)行分子量巨大的DNA片段的脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制備分子量大于200kb的DNA。該法的細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（即染色質(zhì)），然后通過火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶和有機(jī)溶劑。甲酰胺是一種離子化溶劑，既可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，還可使釋放的蛋白質(zhì)變性。但甲酰胺對(duì)蛋白酶K的活性無顯著影響。本法因操作步驟少，尤其省卻了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。

（三）玻棒纏繞法

纏繞法適于同時(shí)從不同的細(xì)胞或組織標(biāo)本中提取DNA。與前兩個(gè)方案不同，它有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀于細(xì)胞裂解液與乙醇液的交界面；二是要將沉淀的DNA纏繞于帶鉤玻棒上。通過帶鉤玻棒將高分子量DNA沉淀從乙醇溶液中轉(zhuǎn)移到pH8.0的TE溶液重溶。小的DNA片段與RNA不能有效形成凝膠狀線卷。該方案以鹽酸胍裂解細(xì)胞，制備的DNA分子量只有大約80kb，不能有效構(gòu)建基因組DNA文庫，但用于Southern雜交和PCR反應(yīng)可以獲得很好的結(jié)果。

（四）DNA樣品的進(jìn)一步純化

純化的方法包括透析、層析、電泳及選擇性沉淀等。其中電泳法簡(jiǎn)單、快速、易于操作、分辨率高、靈敏度好、易于觀察及便于回收，在DNA的進(jìn)一步純化中占有重要的地位。由于聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel）與瓊脂糖凝膠（agarose gel）可以制成各種形狀、大小和孔徑不一的支持體，并可以在多種裝置中進(jìn)行電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）與瓊脂糖凝膠電泳（AGE）廣泛用于核酸的分離、純化與鑒定。

二、DNA片段的回收

通過凝膠電泳，我們可以對(duì)各種大小與來源的DNA片段進(jìn)行分離、純化與鑒定。目前，瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠是最常使用的電泳支持體，電泳分離的DNA處于凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。下面介紹從瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的主要方法。

（一）總的原則與要求

無論采用何種方法從何種支持介質(zhì)中回收DNA片段，都要注意兩個(gè)原則。一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA樣品中的污染。

回收的DNA樣品往往因支持介質(zhì)的不純、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，這些污染可能嚴(yán)重影響后繼的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)對(duì)回收的DNA樣品進(jìn)行純化，以除去污染物。常用的純化方法包括有機(jī)溶劑抽提法與商品化的柱層析法。其中柱層析法采用陰離子交換層析的原理，主要是利用帶負(fù)電荷的DNA在低離子強(qiáng)度的緩沖液中與陰離子交換樹脂結(jié)合，洗去雜質(zhì)，然后再用高離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫下來。上述兩種純化方法以及其它回收DNA片段的方法，最終均要在有鹽的情況下進(jìn)行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有機(jī)分子與共沉淀的鹽。

（二）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法主要包括二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）纖維素膜插片電泳法、電泳洗脫法、冷凍擠壓法及低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。

1．DEAE纖維素膜插片電泳法  DEAE纖維素是一種陰離子交換纖維素，可以結(jié)合帶負(fù)電荷的DNA分子。將DEAE纖維素膜插入到經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離的核酸條帶前，繼續(xù)電泳直至所需回收的DNA片段剛好轉(zhuǎn)移到膜上。取出DEAE纖維素膜，低鹽條件下洗去雜質(zhì)，高鹽條件下洗出DNA分子。該法操作比較簡(jiǎn)單，可同時(shí)回收多個(gè)DNA片段，對(duì)500bp～5kb的DNA片段回收率好，純度高，能滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求。但DNA片段大于5kb時(shí)，因結(jié)合力增大而回收率下降。至10kb或?yàn)閱捂?/span>DNA時(shí)，其與膜的結(jié)合變得很牢固而難以回收。因此，本法不適合于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收單鏈DNA。

2．電泳洗脫法  電泳洗脫法包括兩個(gè)主要步驟，一是將待回收的DNA片段電泳出凝膠介質(zhì)，使其進(jìn)入一個(gè)便于回收的小容積溶液中；二是分離純化出DNA片段。按是否使用透析袋可分為透析袋電泳洗脫法與非透析袋電泳洗脫法兩大類。其中，透析袋電泳洗脫法需要切下含待回收DNA片段的凝膠條，然后放入透析袋內(nèi)進(jìn)行電泳，使DNA分子遷移出凝膠條進(jìn)入透析袋的溶液中，最后經(jīng)抽提純化回收DNA分子。該法操作很不方便而且不適合于同時(shí)回收大量不同的DNA片段，但可有效回收從200bp至大于50kb的DNA，尤其對(duì)大于5kb的DNA有良好的回收率。

3．低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法  該法是從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中切出含待回收DNA的凝膠塊，利用其純度高、熔點(diǎn)低（65℃）及凝固溫度低（30℃）的特點(diǎn)，在室溫大于30℃，瓊脂糖仍為液態(tài)的情況下，對(duì)DNA片段進(jìn)行回收的方法。根據(jù)不同的提取純化方案，又可分為有機(jī)試劑提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法和瓊脂水解酶（agarase）法。有機(jī)試劑法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb～5kb的DNA片段。玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法是將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉（NaI）溶液或高氯酸鈉溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下來。玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法較有機(jī)試劑提取法快，但回收率略低。瓊脂水解酶法對(duì)切下的含DNA的凝膠塊進(jìn)行消化，將瓊脂糖水解為二糖，釋放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。

目前，有許多能從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法與改良方案，但至今尚無一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同時(shí)回收幾種DNA片段并有效去除凝膠中酶促反應(yīng)抑制劑（如多糖類）。每種方法各有其特點(diǎn)，各有其適用范圍，應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同的方法并對(duì)某些步驟做出相應(yīng)的調(diào)整。

（三）從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段

從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。它是將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使DNA洗脫出來。該法能很好回收小于1kb的單鏈或者雙鏈DNA，且純度很高，無酶抑制劑，也無對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或微注射細(xì)胞有毒的污染物，雖費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。依分子量不同，其回收率從小于30%至大于90%不等。如果將切下的聚丙烯酰胺凝膠塊包埋于瓊脂糖凝膠中，再進(jìn)行DEAE纖維素膜插片法電泳或透析袋電泳洗脫，可以縮短雙鏈DNA的回收時(shí)間。

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三、基因組DNA分離純化的方法學(xué)評(píng)價(jià)與質(zhì)量保證

 

有關(guān)基因組DNA分離純化的方法很多，每一種方法下又可衍生出許多具體的實(shí)驗(yàn)方案。對(duì)每一個(gè)具體的實(shí)驗(yàn)方案，大體上我們可以從方法的可行性與可靠性兩個(gè)方面來加以考察?？尚行苑矫姘ǚ椒ㄊ欠窈?jiǎn)便、快速、安全及成本如何?？煽啃詣t包括了方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、特異性、產(chǎn)出比、最大產(chǎn)量及最小樣品用量等。另一方面，由于酚具有高度的腐蝕性，需要采取特別的安全防護(hù)措施。