无码人妻久久一区二区三区免费丨,91精品欧美久久久久久,色肉色伦交av色肉色伦,操逼贱货调教操骚逼视频

       親和素與生物素之間非常穩(wěn)定的、非共價作用在化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域是最常運用的工具之一。生物素是復(fù)合維生素B2的組成部份。它與雞清蛋白、親和素、真菌蛋白、鏈霉親和素均有較高親和性和結(jié)合力。親和素和鏈霉親和素都是四聚體蛋白，可緊緊地結(jié)合四分子D-biotin，其結(jié)合力是已知自然界中最強的非共價作用（K_d = 10^-15 M)。

       生物素與親和素之間的相互作用可用于蛋白純化、檢測、固化、藥物導(dǎo)向、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等。

       檢測與某一多肽相互作用的物質(zhì)，最簡單的方法就是利用此多肽做親和pull-down實驗，然后直接檢測結(jié)合蛋白。蛋白質(zhì)體外結(jié)合(Pull-down)試驗可用于驗證蛋白-蛋白相互作用的存在（經(jīng)由別的研究方法預(yù)測過的，如免疫共沉淀）和作為一種初級的篩選試驗來識別一些未知的蛋白-蛋白相互作用。通過競爭性阻斷結(jié)合，合成肽通常被用來驗證被假設(shè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
       生物素標記肽含有一個特殊的功能區(qū)和相當于參照的未修飾肽，此肽可被錨定在親和素共軛的磁珠上，將這些磁珠與目標樣本共同孵育（如核提取物或純化的重組蛋白），通過洗滌去除未結(jié)合的蛋白，然后洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)， SDS/ PAGE分析，經(jīng)蛋白染色即可直接觀察。通過比較分別與修飾和未修飾多肽相結(jié)合的蛋白質(zhì)，即有可能確定候選者，即特定功能蛋白的“reader”蛋白。
       帶有一些特殊修飾的生物素標記肽可以通過化學(xué)合成，純度達80％以上。肽長度應(yīng)該在15-20個氨基酸。目標修飾位于序列中間時，兩翼氨基酸殘基不能少于6-8個。一般情況下，生物素多被偶聯(lián)在N末端或C末端。如果無特殊要求，我們建議生物素偶聯(lián)至N-末端，其優(yōu)勢是修飾的成功率更高，生產(chǎn)的時間更短，并且易于操作。此外，如果偶聯(lián)至C-末端，需要額外增加一個賴氨酸。

生物素標記肽的Pull-down實驗方案
       生物素標記肽可與親和素磁珠共軛以生成樹脂，用于肽pulldown試驗。先把生物素標記肽上樣至Immobilized streptavidin beads (PuriMag G-Strep磁珠) 錨定有親和素的磁珠上，再與細胞裂解液孵育。細胞裂解于1％（v/v）Nonidet P-40, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, protease inhibitors (Complete Tablets, Roche Applied Science), 加入 1 mM sodium orthovanadate作為磷酸酶抑制劑。等量的蛋白質(zhì)分別與被錨定的多肽在4℃孵育6小時。經(jīng)過大量洗滌，在SDS樣品buffer中煮沸，結(jié)合蛋白可從被錨定的多肽洗脫下來，或者，用50 mM dithiothreitol將多肽與蛋白復(fù)合物從磁珠中斷開。將來自活性肽和對照目標肽pull-downs的洗脫液合并，以作進一步的分析。

上圖為鏈霉親和素-生物素鍵力測量示意圖。由于它們異常高的親和結(jié)合性，其中最突出的配體-受體對是鏈霉親和素-生物素（streptavidin-biotin）和親和素-生物素（avidin-biotin）。 這兩種蛋白質(zhì)都有一個四聚體的結(jié)構(gòu)，這樣他們可以結(jié)合4個配體。

       通常，生物素可被標記在N端或C端(經(jīng)由Lys)。我們推薦N端標記，其標記的成功率更高，所需時間更短，操作更簡潔。多肽都是由C端向N端合成。在SPPS合成草案中，N端修飾是其最后一步，不再需要其他特別連接步驟。相反，C端修飾不僅需要額外的步驟，而且過程更復(fù)雜。但是，理論上，生物素化可被定位在任何位置。
生物素可通過各種不同的linker或spacers與多肽隔離。一般建議引入間隔器如Ahx（一個6碳鏈接器)讓生物素更穩(wěn)定或更靈活。

N端或C端生物素標記：Biotin (N terminus), Lys(Biotin)(middle), Lys(Biotin)(C terminus)。
帶有l(wèi)inker(Ahx)的生物素化: Biotin-Ahx (N terminus), Lys(Ahx-Biotin)(middle), Lys(Ahx-Biotin)(C terminus)。

蛋白研究領(lǐng)域的應(yīng)用
       在許多蛋白研究領(lǐng)域中，生物素標記肽通常與親和素結(jié)合而被檢測或純化：: 免疫印跡（WB）、ELISA、免疫沉淀 (IP)、,多肽親和純化、免疫組化 (IHC)、細胞表面標記、流式細胞術(shù)/熒光激活細胞分類(FACS)。
       鎖定蛋白或其他蛋白復(fù)合物，使用生物素化多肽作為誘餌可從某樣品中捕獲某一假定的結(jié)合成份。其中一個策略就是使用鏈霉親和素一步法捕獲體內(nèi)生物素化蛋白和串聯(lián)親和純化，即傳統(tǒng)親和標簽（FLAG或6HIS）外加一個生物素多肽。
       首先將生物素標記肽固化在親和支撐材料上，例如親和瓊脂糖。
       與固相載體一起孵化天然樣品。
       洗掉固相載體中未結(jié)合的樣品成份。
       通過改變緩沖液條件來洗脫目的分子及其關(guān)聯(lián)蛋白。
       生物素-親和素的親和力越高，對洗脫條件的要求越嚴。這一特點將有效減少其他親和標簽或天然抗體的背景結(jié)合。所以它很方便地用來確定兩個純化蛋白質(zhì)在各種緩沖液中的相互影響（結(jié)合）能力。
       僅有很少的天然生物素蛋白。所以交叉反應(yīng)的機率非常低。生物素酰化從而可以用來從細胞裂解液中獲得蛋白質(zhì)相互作用信息。