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生物交聯(lián)技術(shù)——交聯(lián)劑功能及使用特點(diǎn)

來源:美博泰生物科技 2025-4-22 9:26:42??????點(diǎn)擊:

普通交聯(lián)劑

普通交聯(lián)劑共十種:EDC、CMC、DCC、DIC、NHS、Slufo-NHS、MAL、NEM、SFB、丁二酸酐。

1. 碳二亞胺鹽酸鹽  EDC


圖1 EDC分子結(jié)構(gòu)

EDC和其他碳二亞胺是零長度交聯(lián)劑。它們使羧酸(-COOH)與伯胺(-NH2)直接偶聯(lián),而不會(huì)成為靶標(biāo)分子之間最終酰胺鍵交聯(lián)的一部分。因?yàn)槎嚯暮偷鞍缀卸鄠€(gè)羧基和氨基,EDC直接介導(dǎo)的交聯(lián)通常會(huì)造成多肽的隨機(jī)聚合。EDC 首先與羧基發(fā)生反應(yīng),形成胺反應(yīng)性 O-?;愲逯虚g體,該中間體可與氨基快速反應(yīng)形成酰胺鍵,釋放異脲副產(chǎn)物。中間體在水性溶液中不穩(wěn)定,因此兩步偶聯(lián)程序依賴于 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 進(jìn)行穩(wěn)定。在存在 N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)的情況下,EDC 可用于將羧基轉(zhuǎn)換為胺反應(yīng)性磺基-NHS 酯。這是通過將 EDC 與含有羧基的分子混合并添加磺基-NHS 來實(shí)現(xiàn)的。如果不與胺發(fā)生反應(yīng),將導(dǎo)致中間體的水解、羧基的再生和 N-取代尿素的釋放。副反應(yīng)是形成 N-酰脲,通常僅限于位于蛋白疏水性區(qū)域的羧基。該交聯(lián)劑已用于多種應(yīng)用,如在肽合成中形成酰胺鍵、連接半抗原與載體蛋白形成免疫原、通過 5' 磷酸基標(biāo)記核酸以及構(gòu)建生物分子的胺反應(yīng)性 NHS 酯。  

2. N-環(huán)己基-N′-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對(duì)甲苯磺酸鹽  CMC


圖 2 CMC分子結(jié)構(gòu)

CMC是除EDC之外另外一種水溶性碳二亞胺試劑。用于羧基和氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵;在親和色譜中用作偶聯(lián)配體;可與巰基反應(yīng)生成穩(wěn)定的化合物。也用于 RNA 中假尿嘧啶殘基的簡單測(cè)序技術(shù)。  

3. N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺  DCC


圖 3 DCC分子結(jié)構(gòu)

在肽合成中,DCC常被用來活化羧基,是一種很好的低溫生化脫水劑,也用于酸、酐、醛、酮等的合成。不溶于水,在有機(jī)相反應(yīng)居多。DCC可用于促進(jìn),7-(叔-丁基二甲基硅基)氧與丙酸的酯化反應(yīng)生成7-(叔-丁基二甲基硅基)氧庚-2,4-二炔-1-醇。[3]還可用于合成:①通過2-苯乙烯基和2-(4-硝基苯基)異硫氰酸酯[2+2]環(huán)加成合成:1,3-噻唑烷衍生物。②1,3,5-惡二嗪-4-硫酮與苯甲酰異硫氰酸酯[4+2]環(huán)加成反應(yīng)。③在芳香族(或異芳香族)羧酸存在下,通過與(N-異環(huán)氨基)三苯基磷烷反應(yīng),生成空間位阻的1,3,4-惡二唑衍生物。 

4. N,N′-二異丙基碳二亞胺  DIC


圖 4 DIC分子結(jié)構(gòu)

DIC是肽合成的偶聯(lián)劑。替代肽合成中的二環(huán)己基碳二亞胺。水不溶性,常溫下液體,比DCC更易分散均勻。  

5. N-羥基丁二酰亞胺  NHS


圖 5 NHS分子結(jié)構(gòu)

運(yùn)用碳二亞胺方法,在改進(jìn)的酰胺化以及肽偶聯(lián)反應(yīng)中的添加劑;用于在酰胺鍵形成時(shí)活化羰基基團(tuán)。NHS 的特點(diǎn):①NHS 的存在使 EDC 介導(dǎo)偶聯(lián)的效率提高;②可使用任何含羧基的分子制備胺反應(yīng)性 NHS 酯;③典型小分子(例如生物素)的 NHS 衍生物不帶電荷、有機(jī)可溶(首先溶于 DMSO)且具有細(xì)胞膜可透過性;④高純度結(jié)晶 NHS 可用于生成高質(zhì)量活化衍生物。N-羥基丁二酰亞胺可用于合成氨基酸保護(hù)劑、半合成卡那霉素及醫(yī)藥中間體。  

6.N-羥基硫代琥珀酰亞胺 鈉鹽  Slufo-NHS


圖 6 Slufo-NHS分子結(jié)構(gòu)

Slufo-NHS是NHS的一種水溶性磺化類似物,用于蛋白的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。Sulfo-NHS的特點(diǎn):① Sulfo-NHS提高EDC介導(dǎo)的偶聯(lián)效率;② 能夠利用任何含羧基分子形成氨基反應(yīng)性Sulfo-NHS酯;③ Sulfo-NHS衍生物通常直接溶于水(可直接加入生理緩沖液中),不可穿透細(xì)胞膜(可用于標(biāo)記細(xì)胞表面);④ 高純度的晶體Sulfo-NHS可用于生成高品質(zhì)活化衍生物。Sulfo-NHS能夠控制和修飾碳二亞胺交聯(lián)反應(yīng),包括活化羧酸根(—COOH)以偶聯(lián)伯胺基(—NH2)。通過將Sulfo-NHS與一種含羧基分子及一種脫水試劑(如碳二亞胺EDC(EDAC))混合,可以方便地合成相關(guān)衍生物。該方法是制備許多類型蛋白標(biāo)記試劑的基礎(chǔ),包括氨基反應(yīng)性熒光染料、生物素親和標(biāo)簽和聚乙二醇化化合物。  

7. 馬來酰亞胺   MAL


圖 7 MAL分子結(jié)構(gòu)

馬來酰亞胺(2,5-吡咯二酮) 是一種新型納米顆粒表面官能團(tuán),易于與細(xì)胞穿透肽偶聯(lián);通過點(diǎn)擊化學(xué)可實(shí)現(xiàn)偶聯(lián),同時(shí)保留其生物功能。馬來酰亞胺用于,銠催化的芳基硼酸共軛芳基化反應(yīng)。馬來酰亞胺官能化二氧化硅顆??捎糜诠潭ㄅQ灏椎鞍祝˙SA)-硼酸(BA)偶聯(lián)物。  

8. N -乙基馬來酰亞胺    NEM


圖 8 NEM分子結(jié)構(gòu)

NEM用于共價(jià)修飾蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基的試劑,疏基烷化劑,使依賴于NADP的異檸檬酸脫氫酶和許多的內(nèi)切酶失活。水溶液不穩(wěn)定,水解速率為假一級(jí),顯著依賴于pH值。  

9. 對(duì)甲?;郊姿?N-羥基琥珀酰亞胺酯   SFB


圖 9 SFB分子結(jié)構(gòu)

SFB末端含醛基的氨基反應(yīng)活性試劑,用于引入醛基,特別是雜交反應(yīng)中堿性磷酸酶的醛基化。  

10. 丁二酸酐(二氫-2,5-呋喃二酮)


圖 10 丁二酸酐分子結(jié)構(gòu)

丁二酸酐易水解、胺化,用于固相氨基表面的共價(jià)修飾。丁二酸酐是丁二酸的五元環(huán)環(huán)酸酐。它被廣泛應(yīng)用于高分子材料、醫(yī)藥、農(nóng)用化學(xué)品、染料、表面活性劑、有機(jī)阻燃材料的制造。它也可作為離子交換膜的交聯(lián)劑和環(huán)氧樹脂的固化劑??捎糜谥苽洌孩俟矁r(jià)交聯(lián)的氧化藻酸鹽/N-琥珀酰-殼聚糖水凝膠,作為組織工程的注射系統(tǒng)。②制備芯片上的功能化氧化物表面。③作為起始原料,以金屬三氟酸鹽作為催化劑合成聚酯。④作為交聯(lián)劑提高玉米蛋白膜的力學(xué)性能和抗菌活性。


同型雙功能交聯(lián)劑

同型雙功能交聯(lián)劑在間隔臂兩端具有相同的反應(yīng)基團(tuán)(圖1)。通常,它們只能用于一步法反應(yīng)過程中,以隨機(jī)“固定”或聚合含有相似功能基團(tuán)的分子。例如,將氨基-氨基交聯(lián)劑添加到細(xì)胞裂解液中,將導(dǎo)致蛋白質(zhì)亞基、相互作用蛋白質(zhì)以及在溶液中其賴氨酸側(cè)鏈恰好彼此鄰近的任何其他多肽發(fā)生隨機(jī)偶聯(lián)。這是捕獲所有蛋白質(zhì)相互作用的“快照”的理想方法,但不能滿足需要精確交聯(lián)的應(yīng)用需求。以氨基微球?yàn)槔?,我們可以選擇兩端同時(shí)含有醛基、NHS酯等具備氨基反應(yīng)活性的交聯(lián)劑,交聯(lián)劑的一端可以與微球表面的氨基反應(yīng),另外一端則與抗體上的氨基反應(yīng)(如圖2)。但由于交聯(lián)劑兩端的官能團(tuán)均可與微球表面的氨基反應(yīng),若條件不當(dāng),則容易因微球自身交聯(lián)而產(chǎn)生聚集,為了避免該現(xiàn)象的發(fā)生,該反應(yīng)需要添加大大過量的交聯(lián)劑。


圖1. 戊二醛分子結(jié)構(gòu) 同型雙功能交聯(lián)劑示例


圖 2   戊二醛法偶聯(lián)氨基微球

這里介紹十種同型雙功能交聯(lián)劑,分別為:戊二醛、DSS、DSG、DMA、DMP、DMS、DTBP、DSP、DTSSP、Sulfo--EGS。  

1. 戊二醛

戊二醛(見圖1)是一種常用的液體同型雙功能交聯(lián)劑。戊二醛易溶于水(混溶),商品化戊二醛通常為20%~70%水溶液。在已知醛中,戊二醛是一種最好的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑,交聯(lián)的特點(diǎn)是活性高,反應(yīng)快,結(jié)合量高,產(chǎn)物穩(wěn)定,對(duì)沸水、酸、酶的抵抗能力強(qiáng)。  

2. 辛二酸雙(N-羥基琥珀酰亞胺酯) DSS


圖 3  DSS分子結(jié)構(gòu)

DSS是一種常用的簡單交聯(lián)劑,其在短間隔臂的兩端具有相同的靶向氨基的NHS酯基團(tuán)。包含8個(gè)原子的連接基(8個(gè)碳原子長鏈),間隔臂長度(11.4?)是最終的偶聯(lián)分子(即靶標(biāo)氨基中的氮分子)之間的最大分子距離。DSS是一種膜可滲透的同型雙功能交聯(lián)劑。疏水性,使用前需先溶于有機(jī)溶劑。

3. 雙琥珀酰亞胺戊二酸酯 DSG


圖 4  DSG分子結(jié)構(gòu)

DSG是一種氨基反應(yīng)活性試劑,含5個(gè)碳原子長鏈;疏水性,使用前需先溶于有機(jī)溶劑。DSG 是一種可降解 (cleavable) 的 ADC 交聯(lián)劑,用于合成可用于合成抗體偶聯(lián)藥物 (ADC)。  

4. 二甲基己二酸 DMA


圖 5  DMA分子結(jié)構(gòu)

DMA是一種用于蛋白質(zhì)研究的交聯(lián)劑。氨基反應(yīng)活性試劑,含6個(gè)碳原子長鏈;水溶性,適用于交聯(lián)、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)修飾。該試劑在中性 PH 下易水解。  

5. 二甲基吡咪酯 DMP


圖 6  DMP分子結(jié)構(gòu)

DMP是一種同型雙功能交聯(lián)劑,適用于交聯(lián)、蛋白相互作用和蛋白修飾。試劑在中性pH下易于水解。通常,在pH7.0-10.0的范圍內(nèi),與伯胺反應(yīng)形成脒鍵。氨基反應(yīng)活性試劑,含7個(gè)碳原子長鏈;水溶性。  

6. 丙二酸二甲酯 DMS


圖 7  DMS分子結(jié)構(gòu)

DMS是氨基反應(yīng)活性試劑,含8個(gè)碳原子長鏈;水溶性,適用于交聯(lián)、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)修飾。該試劑在中性 pH 下易水解。作為以下反應(yīng)的反應(yīng)物:①酪氨酸酶的化學(xué)修飾以進(jìn)行偶聯(lián),從而產(chǎn)生生物催化酶流動(dòng)檢測(cè)器。②合成膠原-磷酸鈣復(fù)合材料的交聯(lián)劑。  

7. 3,3′-二硫代雙丙亞氨酸二甲酯 二鹽酸鹽 DTBP


圖 8  DTBP分子結(jié)構(gòu)

DTBP是可硫醇裂解的同雙功能胺反應(yīng)性交聯(lián)劑。氨基反應(yīng)活性試劑,含8個(gè)碳原子長鏈;水溶性,適用于交聯(lián)、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)修飾。該試劑在中性PH 下易水解。在偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)應(yīng)避免使用還原劑,其中心二硫鍵可以被還原劑裂解。它包含一個(gè)胺反應(yīng)性亞氨酸酯,亞氨酸酯在 pH 值 8-10 下與伯胺反應(yīng)形成穩(wěn)定的脒鍵。脒發(fā)生質(zhì)子化,因此,與其修飾的賴氨酸一樣,在生理 pH 值下具有正電荷。  

8. 二硫雙(琥珀酰亞胺丙酸酯) DSP


圖 9  DSP分子結(jié)構(gòu)

DSP是水不溶性(首先溶于 DMF 或 DMSO)、同型雙功能 N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS 酯)交聯(lián)劑,具有硫醇可切割性、伯胺反應(yīng)性,適用于多種應(yīng)用。DSP 在8個(gè)碳原子間隔臂的每端有一個(gè)胺反應(yīng)性 NHS 酯。NHS 酯在 pH 值 7–9 的條件下與伯胺反應(yīng)可形成穩(wěn)定的酰胺鍵,并釋放 N-羥基琥珀酰亞胺。蛋白(包括抗體)通常在賴氨酸 (K) 殘基的側(cè)鏈和每個(gè)多肽的 N 端有若干伯胺,這些伯胺可用作 NHS 酯交聯(lián)試劑的靶標(biāo)。如果相關(guān)的應(yīng)用需要一個(gè)在還原劑條件下不能裂解的穩(wěn)定間隔臂,也可使用 DSP 交聯(lián)劑的不可切割類似物 DSS。  

9. 3,3’-二硫雙(磺基琥珀酰亞胺丙酸酯) DTSSP


圖 10  DTSSP分子結(jié)構(gòu)

DTSSP(Sulfo-DSP)是一種廣泛采用的水溶性交聯(lián)劑,其含有胺反應(yīng)性 N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)酯,位于8碳間隔臂的各端?;腔?NHS 酯在 pH 7-9 條件下與伯胺反應(yīng)可形成穩(wěn)定的酰胺鍵,同時(shí)釋放 N-羥基磺基琥珀酰亞胺離去基團(tuán)。蛋白(包括抗體)通常在賴氨酸 (K) 殘基的側(cè)鏈中有若干伯胺和每個(gè)多肽的 N 端,這些多肽可用作 Sulfo-NHS 酯交聯(lián)試劑的靶標(biāo)。DTSSP間隔臂中的二硫鍵在pH 8.5條件下易于被10-50mM DTT或TCEP裂解,不可透過膜,允許細(xì)胞表面標(biāo)記。DSS(DTSSP 的非磺化類似物)也可用于需要膜可透過性交聯(lián)劑的應(yīng)用。  

10. 乙二醇雙(磺基琥珀酰亞胺琥珀酸酯) Sulfo--EGS


圖 11  Sulfo-EGS分子結(jié)構(gòu)

Sulfo-EGS 是一種水溶性交聯(lián)劑,含有位于 12 原子間隔臂周圍的胺反應(yīng)性 sulfo-NHS 酯末端,其可通過在 pH 值 8.5 時(shí)使用羥胺處理進(jìn)行裂解。氨基反應(yīng)活性試劑,水溶性,空間臂含有兩個(gè)酯鍵,可在羥胺作用下裂解生成兩個(gè)末端氨基的化合物,釋放乙二醇。膜不滲透性,可進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記;在 pH 值為 8.5 時(shí)于 37°C 下使用羥胺處理持續(xù) 3 至 6 小時(shí),形成的交聯(lián)是可逆的。


上一篇文章介紹了什么是同型雙功能交聯(lián)劑,以及其中十種同型雙功能交聯(lián)劑:戊二醛、DSS、DSG、DMA、DMP、DMS、DTBP、DSP、DTSSP、Sulfo--EGS。本篇繼續(xù)簡單介紹一些常用的同型雙功能交聯(lián)劑的特性:BS(PEG)5、BS(PEG)9、碳酰肼、ADH、BMOE、Bis-Mal、DPDPB、Mal-PEG-Mal、CDI、DSC。  

1. 雙-五聚乙二醇-琥珀酰亞胺酯BS(PEG)5



圖1 BS(PEG)5分子結(jié)構(gòu)
BS(PEG)5是氨基反應(yīng)活性試劑,通過柔性PEG間隔臂不可逆地交聯(lián)蛋白質(zhì)或肽;適合小分子或肽結(jié)合;具有確定的分子量和間隔臂長的均質(zhì)化合物,提高交聯(lián)精度。在 pH 7-9 下,NHS 酯與 -NH2 基反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。PEG間隔臂提供獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),包括增加穩(wěn)定性、降低聚集傾向和降低免疫原性。BS(PEG)9與BS(PEG)5特性較為相似。  


2. 碳酰肼



圖2 碳酰肼分子結(jié)構(gòu)
碳酰肼水溶性佳,可與含醛或酮的分子反應(yīng)生成腙。具有很強(qiáng)的還原性,無毒,可替代水合肼、肟類。通過縮合反應(yīng),與各種醛和配體合成多齒席夫堿配體??捎米麇仩t水的除氧劑??捎米骰鸺七M(jìn)劑的組分,彩色顯影和肥皂質(zhì)量的穩(wěn)定劑,橡膠的抗氧劑,鍋爐水除氧劑,以及金屬的鈍化劑等。還可以用作化纖行業(yè)作彈性纖維的交聯(lián)劑。  


3. 己二酸二酰肼  ADH



圖3 ADH分子結(jié)構(gòu)
己二酸二酰肼對(duì)醛類具有特異性,從而形成相對(duì)穩(wěn)定的肼鍵;通常用于糖蛋白(如抗體)的連接,在高碘酸氧化后以特定的位點(diǎn)方式進(jìn)行連接。在pH5.0條件下,由于肼的pKa較低,避免了伯胺的競爭,所以氧化和偶聯(lián)可以順利地進(jìn)行。ADH是一種低分子量化合物,每個(gè)末端都包含一個(gè)酰肼基團(tuán)。這可為重金屬提供額外的吸附位點(diǎn),從而維持或提高交聯(lián)吸附劑的吸附能力。ADH可用作多個(gè)領(lǐng)域的交聯(lián)劑,如制造機(jī)械乳膠膜和可注射氧化透明質(zhì)酸水凝膠。  


4. 雙馬來酰亞胺乙烷 BMOE



圖4 BMOE分子結(jié)構(gòu)
BMOE 是一種馬來酰亞胺交聯(lián)劑,用于巰基基團(tuán)(例如,蛋白或肽半胱氨酸)之間的不可逆共價(jià)偶聯(lián)。短(8.0?) 巰基-巰基交聯(lián)劑,由馬來酰亞胺基團(tuán)和7-原子間隔臂組成;最短的雙馬來酰亞胺交聯(lián)劑,可用于近距離交聯(lián)。不溶于水,首先溶于 DMF 或 DMSO 中,然后添加至水性反應(yīng)緩沖液。BMOE、BMB和BMH是同型雙功能馬來酰亞胺交聯(lián)劑,可用于巰基(-SH)之間的綴合。此類雙馬來酰亞胺交聯(lián)劑通常用于探索和表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(即,寡聚化)或蛋白質(zhì)相互作用。因?yàn)锽MOE、BMB和BMH具有相同的反應(yīng)性但長度不同,因此這三種試劑在蛋白質(zhì)寡聚體中位點(diǎn)之間形成交聯(lián)或相互作用的相對(duì)成功性可有助于確定分子內(nèi)和分子間的距離。  


5. N,N′-(4,4′-亞甲基二苯基)雙馬來酰亞胺 Bis-Mal



圖5 Bis-Mal分子結(jié)構(gòu)
Bis-Mal是一種同型雙功能交聯(lián)劑。用于固化桐酸縮水甘油酯(GEEA)。作為雙馬樹脂基體,具有突出的特性:抗熱性、抗氧化性、抗輻射性。廣泛應(yīng)用于電力、航空、航天、計(jì)算機(jī)、通訊、汽車、鐵路、建筑等工業(yè)領(lǐng)域。  


6. N,N'-(丁烷-1,4-二基)雙(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺) DPDPB



圖6 DPDPB分子結(jié)構(gòu)
DPDPB是巰基-巰基交聯(lián)劑,與兩個(gè)含巰基基大分子反應(yīng)后得到中間臂為14個(gè)原子的碳鏈,臂長約為16?;水不溶性,使用前需先溶于有機(jī)溶劑。  


7. Mal-PEG-Mal



圖7 Mal-PEG-Mal分子結(jié)構(gòu)
Mal-PEG-Mal是巰基-巰基交聯(lián)劑,PEG間隔臂分子量為2000或5000,適用于交聯(lián)蛋白質(zhì)或肽;提高交聯(lián)產(chǎn)物的水溶性及抗蛋白降解能力?;罨腜EG衍生物可用于修飾肽、蛋白質(zhì)或其它生物交聯(lián)應(yīng)用。聚乙二醇化的材料已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在藥物輸送系統(tǒng),病毒學(xué)和免疫學(xué)中的廣泛使用,作為PEG的摻入改善藥理學(xué)特性,如增加水溶性,增強(qiáng)抗降解(蛋白質(zhì)水解),增加循環(huán)半衰期,并降低抗原性。除了聚乙二醇化,活化的PEG衍生物也可以用來形成用于組織工程或藥物輸送應(yīng)用的網(wǎng)絡(luò),這取決于架構(gòu)和反應(yīng)性。  


8. 羰基二咪唑 CDI



圖8 CDI分子結(jié)構(gòu)
CDI是羰基化試劑,可與帶羰基或羰基的分子反應(yīng),生成氨基反應(yīng)活性的中間體,是合成氨基甲酸酯類化合物的重要試劑。CDI是咪唑的衍生物,其咪唑結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)閉合的大P鍵,且其中一個(gè)氮原子未成鍵的sp2軌道上有一對(duì)孤對(duì)電子。這些決定了CDI具有較強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性,能與氨、醇、酸等官能團(tuán)反應(yīng),合成許多用一般化學(xué)方法難以得到的化合物。廣泛用作酶和蛋白質(zhì)粘合劑,抗生素類合成藥物中間體,特別是作為合成多肽化合物的鍵合劑。  


9. N-琥珀酰氨基碳酸酯 DSC


圖9 DSC分子結(jié)構(gòu)

對(duì)親核試劑有高反應(yīng)活性,可與帶氨基的分子反應(yīng)生成尿素類似物,或在無水有機(jī)相活化帶羧基的分子,生成氨基反應(yīng)活性的中間體,用于建立羧基和氨基之間的連接,是合成氨基甲酸酯類化合物的重要試劑。


異型雙功能交聯(lián)劑

異型雙功能交聯(lián)劑的兩端具有不同的反應(yīng)基團(tuán)(圖1)。這些試劑不僅可以對(duì)具有各自靶標(biāo)功能基團(tuán)的分子進(jìn)行單步法偶聯(lián),而且可以進(jìn)行順序(兩步法)偶聯(lián),最大程度的減少不想要的聚合或自身偶聯(lián)。在順序偶聯(lián)過程中,首先使用交聯(lián)劑最不穩(wěn)定的基團(tuán)使異型雙功能試劑與一種蛋白質(zhì)反應(yīng)。除去過量的未反應(yīng)的交聯(lián)劑后,將經(jīng)修飾的第一種蛋白質(zhì)加入到含有第二種蛋白質(zhì)的溶液中,在該溶液中,通過交聯(lián)劑的第二反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。最廣泛使用的異型雙功能交聯(lián)劑在其一端具有與氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯(NHS酯),另一端具有與巰基反應(yīng)的活性基團(tuán)(例如馬來酰亞胺)。由于NHS酯基團(tuán)在水溶液中較不穩(wěn)定,所以它通常先與一種蛋白質(zhì)反應(yīng)。如果第二種蛋白質(zhì)不具有可用的天然巰基,則可在偶連之前添加一步,使用巰基試劑為該蛋白添加巰基。


圖1.異型雙功能交聯(lián)劑示例

Sulfo-SMCC是一種常用的交聯(lián)劑,其在一端具有與氨基反應(yīng)的Sulfo-NHS酯基團(tuán)(左),在環(huán)己烷間隔臂的相對(duì)端具有與巰基反應(yīng)的馬來酰亞氨基團(tuán)(右)。這使其可以用于兩步法順序偶聯(lián)。這里介紹十種異型雙功能交聯(lián)劑,分別為:2-IT(Traut)、SMCC、LC-SMCC、SM(PEG)n 、碘乙酸-NHS酯、EMCS、Mal-(PEG)n-NHS Ester、MBS、SMPB、SMPH。  

1. 2-亞氨基硫烷鹽酸鹽  2-IT(Traut)


圖 2  2-IT(Traut)分子結(jié)構(gòu)

Traut試劑,蛋白質(zhì)修飾試劑,通常用于將硫醇基團(tuán)連接到蛋白質(zhì)和肽上。Traut 試劑是一種用于硫醇化(巰基加成)的環(huán)狀硫代亞氨酸酯化合物。Traut 試劑與伯胺 (—NH2) 反應(yīng),可在保持與原始氨基類似的電荷特性的同時(shí)引入巰基 (—SH)。一旦添加,就可針對(duì)各種有用的標(biāo)記、交聯(lián)和固定程序中的反應(yīng)特定靶向巰基。用 2-IT 修飾的毛發(fā)角蛋白纖維的拉曼光譜分析。HCl 顯示出新的二硫化物基團(tuán)的形成在 pH 7-10 下,通過脒鍵反應(yīng),得到游離巰基。可用于制備二硫化物和/或硫醚連接的綴合物。注意:脒鍵具有初始伯胺的正電荷以保持蛋白溶解度。包含五個(gè)原子的連接臂,以降低空間位阻。  

2. 4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯 SMCC


圖 3  SMCC分子結(jié)構(gòu)

SMCC是一種異雙功能交聯(lián)劑,其包含一個(gè)具有胺和巰基反應(yīng)性的延長間隔基。它通常首先通過酰胺鍵(pH7.5(7.0-9.0)緩沖)與含有伯胺的分子進(jìn)行偶聯(lián)。第二次偶聯(lián)通過硫醚鍵(pH6.8(6.5-7.0)緩沖)與含有游離巰基的分子進(jìn)行特異性偶聯(lián)。SMCC包含九個(gè)原子連接子。與芳族間隔基相比,延伸的脂族間隔基可在偶聯(lián)之前穩(wěn)定馬來酰亞胺。在水溶液中,NHS 酯水解降解是競爭反應(yīng),其速率隨 pH 值的增加而提高。馬來酰亞胺基團(tuán)比 NHS-酯基團(tuán)更穩(wěn)定,但水解緩慢,且在 pH 值 > 7.5 時(shí)會(huì)失去對(duì)巰基的反應(yīng)特異性。由于這些原因,通常在 pH 7.2–7.5 條件下使用這些交聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián),與 NHS 酯(胺靶向)反應(yīng)的時(shí)間在與馬來酰亞胺(巰基靶向)反應(yīng)之前或二者同時(shí)進(jìn)行??捎糜谥苽涿该庖呓Y(jié)合物和半抗原載體分子結(jié)合物。水不溶性(可首先溶于 DMF 或 DMSO 中,或者選擇水溶性的Sulfo-SMCC )。  

3. 琥珀酰亞胺 4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧基-(6-氨基己酸) LC-SMCC


圖 4  LC-SMCC分子結(jié)構(gòu)

LC-SMCC是SMCC 的長鏈形式,是一種胺對(duì)巰基交聯(lián)劑,含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán),位于長環(huán)己烷穩(wěn)定間隔臂(16.2 埃,SMCC 8.3埃)的相對(duì)兩端。LC-SMCC與SMCC應(yīng)用較為一致。  

4. PEG化,長鏈SMCC交聯(lián)劑  SM(PEG)n


圖 5  SM(PEG)n 分子結(jié)構(gòu)

SM(PEG)n   NHS-和馬來酰亞胺活化的PEG化合物用于蛋白質(zhì)和其他分子中的伯胺(NH 2)和巰基(SH)之間的交聯(lián)。產(chǎn)品提供了一整套化合物,每種化合物具有相同的異雙功能結(jié)構(gòu)(NHS-PEGn-馬來酰亞胺),但離散的乙二醇單元(n = 2,4,6,8,12或24)的數(shù)量不同。N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)基團(tuán)在pH 7-9下與賴氨酸和N-末端氨基能夠發(fā)生有效的特異性反應(yīng),形成穩(wěn)定的酰胺鍵。馬來酰亞胺基團(tuán)在pH 6.5-7.5下與還原型巰基反應(yīng),形成穩(wěn)定的硫醚鍵。通過柔性PEG間隔臂不可逆地交聯(lián)蛋白質(zhì)或肽;聚乙二醇間隔臂有助于保持偶聯(lián)物溶解度;具有確定結(jié)構(gòu)和分子量的純化合物,確保可重復(fù)的蛋白質(zhì)修飾效果;PEG間隔臂提供獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),包括增加穩(wěn)定性、降低聚集傾向和降低免疫原性。  

5. 碘乙酸-NHS酯


圖 6  碘乙酸-NHS酯分子結(jié)構(gòu)

碘乙酸-NHS酯具有氨基和巰基反應(yīng)性的雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑。典型情況下,最初通過 pH 7.5 (6.5-8.5) 緩沖條件下的酰胺鍵偶聯(lián)到含有伯胺的分子上,接著通過 pH 7.5 (7.0-8.0) 緩沖條件下的硫醚鏈與含有自由巰基的分子進(jìn)行特異性次級(jí)鍵合。用于制備酶免疫交聯(lián)劑和半抗原載體分子偶聯(lián)物。提供兩個(gè)原子的連接基。碘乙?;哂泄饷粜?,使用時(shí)注意避光。  

6. 6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯 EMCS


圖 7  EMCS分子結(jié)構(gòu)

EMCS 是一種具有氨基和巰基反應(yīng)性的雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑。含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán),位于中等長度間隔臂(9.4 埃)的相對(duì)兩端。NHS 酯末端在 pH 值 7-9 條件下與伯胺偶聯(lián),形成穩(wěn)定酰胺鍵;馬來酰亞胺在 pH 值 6.5-7.5 條件下與 -SH 基團(tuán)反應(yīng),形成穩(wěn)定硫醚鍵;不溶于水(首先溶于 DMF 或 DMSO中,或者 選擇水溶性的Sulfo-EMCS )。EMCS 是一種制備半抗原結(jié)合物和酶免疫偶聯(lián)物的獨(dú)特而有用的試劑。含有馬來酰亞胺側(cè)鏈作為抗腫瘤劑的阿霉素葡糖苷酸前藥的合成。  

7. 馬來酰亞胺-(PEG)n-琥珀酰亞胺酯 Mal-(PEG)n-NHS Ester


圖 8  Mal-(PEG)n-NHS Ester分子結(jié)構(gòu)

Mal-PEGn-NHS Ester(n=2,6,8,12)是一種具有短環(huán)氧乙烷間隔基的異雙功能交聯(lián)劑,用于將胺基與含巰基化合物或生物分子的連接。馬來酰亞胺官能團(tuán)將與巰基反應(yīng),而琥珀酰亞胺酯基團(tuán)將與胺反應(yīng)。間隔基長度根據(jù)PEG數(shù)量不一樣在 17.6埃~53.3埃間。  

8. 3-馬來酰亞胺基苯甲酸 N -羥基琥珀酰亞胺酯 MBS

圖 9  MBS分子結(jié)構(gòu)

MBS 是一種對(duì)伯胺和巰基具有反應(yīng)性的雙異官能化交聯(lián)劑。通常,初始反應(yīng)在pH為7.0時(shí),通過酰胺鍵偶聯(lián)至含伯胺的分子,然后在相同pH通過硫醚偶聯(lián)至含巰基的化合物。用于制備酶免疫交聯(lián)劑和半抗原載體分子偶聯(lián)物。MBS可用作固定劑,用于保持花粉管纖維狀肌動(dòng)蛋白的分布。它用于花粉管時(shí)產(chǎn)生的損傷較少。水不溶性(可首先溶于 DMF 或 DMSO 中,或者選擇水溶性的Sulfo-MBS)說明:芳基馬來酰亞胺比烷基馬來酰亞胺連接基更不穩(wěn)定。  

9. 琥珀酰亞胺基 4-(p-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯 SMPB


圖 10  SMPB分子結(jié)構(gòu)

SMPB 是一種胺對(duì)巰基交聯(lián)劑,含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán)(位于中等長度芳香族間隔臂(11.6 埃)的另一端);MBS 的擴(kuò)展鏈類似物;;不可裂解;不溶于水(首先溶于 DMF 或 DMSO,或者選擇水溶性的Sulfo-SMPB);與 SMPB 形成的偶聯(lián)物在血清中比 SPDP 偶聯(lián)物更穩(wěn)定。  

10. 琥珀酰亞胺 6-((β-馬來酰亞胺丙酰氨基)己酸) SMPH


圖 11  SMPH分子結(jié)構(gòu)

SMPH 是一種胺對(duì)巰基交聯(lián)劑,含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán),位于長間隔臂(14.2 埃)的相對(duì)兩端。與 SMPB 相比,碳鏈較長且溶解度較高;NHS 酯在 pH 值 7-9 條件下與伯胺反應(yīng),形成穩(wěn)定的酰胺鍵;馬來酰亞胺在 pH 值 6.5-7.5 條件下與 -SH 基團(tuán)反應(yīng),形成穩(wěn)定的硫醚鍵;不可裂解;不溶于水(首先溶于 DMF 或 DMSO)。

上一篇文章介紹了什么是異型雙功能交聯(lián)劑,以及其中十種異型雙功能交聯(lián)劑:2-IT(Traut)、SMCC、LC-SMCC、SM(PEG)n 、碘乙酸-NHS酯、EMCS、Mal-(PEG)n-NHS Ester、MBS、SMPB、SMPH。本篇繼續(xù)簡單介紹一些常用的異型雙功能交聯(lián)劑的特性:SPDP、LC-SPDP、GMBS、BMPS、Sulfo-KMUS、SMPT、SIAB、SATA、SAMSA。  

1. 3-(2-吡啶二硫)丙酸 N -羥基琥珀酰亞胺酯 SPDP


圖 1  SPDP分子結(jié)構(gòu)

SPDP是具有胺和巰基反應(yīng)性的異型雙功能交聯(lián)劑。通常先在pH 7.5(6.5-8.5)的緩沖條件下通過酰胺鍵與含有伯胺的分子偶聯(lián)。在pH 8.0(7.5-8.5)的緩沖條件下通過硫醇-二硫化物交換反應(yīng),與含有游離巰基的分子特異性二次偶聯(lián)。此外,該試劑還可在初次偶聯(lián)和還原接頭后用作受保護(hù)的硫醇化試劑。通常用于氨基微球的硫醇化。SPDP不溶于水(首先溶于 DMF 或 DMSO);SPDP中間臂鏈接PEG相比普通-CH2-具有更佳的水溶性;同時(shí)連接NHS-酯能更好的避免蛋白聚集。應(yīng)用:蛋白的可逆交聯(lián);通過連接至賴氨酸殘基向蛋白添加巰基;通過兩步反應(yīng)蛋白交聯(lián)形成抗體-酶和其他生物偶聯(lián)物;半抗原連接至載體蛋白用于抗體生產(chǎn);制備免疫毒素偶聯(lián)物。 

2. 琥珀酰亞胺 -6(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)已酸酯 LC-SPDP


圖 2  LC-SPDP 分子結(jié)構(gòu)

LC-SPDP 是一種長鏈異型雙功能交聯(lián)劑,可以通過 NHS 酯和吡啶基二硫基反應(yīng)性基團(tuán)與半胱氨酸巰基形成可切割(可還原)二硫鍵,實(shí)現(xiàn)胺與巰基的偶聯(lián)。間隔臂中的二硫鍵在pH 8.5條件下易于被10-50mM DTT或TCEP裂解。SPDP 類試劑的胺反應(yīng)部分是 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。反應(yīng)最通常在 pH 7-8 的磷酸鹽、碳酸鹽/碳酸氫鹽或硼酸鹽緩沖液中進(jìn)行??梢允褂闷渌话罚ɑ蛄虼蓟蚨蚧镞€原劑–參見巰基反應(yīng)性的討論)的緩沖劑。pH 值越高,反應(yīng)和水解降解的速率越大;例如,NHS 酯的半衰期在 pH 值為 7 時(shí)為數(shù)小時(shí),而在 pH 值為 9 時(shí)不到 10 分鐘。SPDP 和 LC-SPDP 等 NHS 酯試劑的水溶性有限,在將其添加到反應(yīng)混合物之前,必須先將其溶于有機(jī)溶劑中。諸如 Sulfo-LC-SPDP 的 Sulfo-NHS-酯試劑是水溶性的,可以直接添加到水性反應(yīng)混合物中。  

3. 4-馬來酰亞胺基丁酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯 GMBS


圖 3  GMBS分子結(jié)構(gòu)

GMBS一種具有胺和巰基反應(yīng)性的異雙功能交聯(lián)劑。通常,最初通過在 pH 7.5 (6.5-8.5) 下緩沖的酰胺鍵與含有伯胺的分子偶聯(lián)。通過硫醚鍵在 pH 6.8 (6.5-7.0) 下緩沖的含游離巰基的分子的特異性二次偶聯(lián)。用于制備酶免疫結(jié)合物和半抗原載體分子結(jié)合物。不溶于水(首先溶于 DMF 或 DMSO,或者選擇水溶性的Sulfo-GMBS)。脂肪族間隔系列的 C4 同系物包括 AMAS、BMPS、GMBS 和 EMCS。  

4. 3-(馬來酰亞胺基)丙酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯 BMPS


圖 4  BMPS分子結(jié)構(gòu)

BMPS 是一種胺對(duì)巰基交聯(lián)劑,含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán),位于短間隔臂 (5.9 ?) 的相對(duì)兩端。用于諸如酶免疫測(cè)定前半抗原與酶交聯(lián)或熒光底物與肽抗原交聯(lián)等技術(shù),用于熒光免疫測(cè)定。  

5. N-κ馬來酰亞胺基十一烷氧基-磺基琥珀酰亞胺酯 Sulfo-KMUS


圖 5  Sulfo-KMUS分子結(jié)構(gòu)

Sulfo-KMUS 是一種水溶性胺對(duì)巰基交聯(lián)劑,含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán),位于長間隔臂 (16.3 ?) 的相對(duì)兩端。NHS酯在pH 7-9時(shí)與伯胺反應(yīng)生成酰胺鍵,馬來酰亞胺在pH6.5-7.5值下與巰基反應(yīng),形成穩(wěn)定的硫醚鍵。在水溶液中,NHS酯的水解降解是一個(gè)競爭反應(yīng),其速率隨pH值的增加而增加。馬來酰亞胺組比NHS-酷組更穩(wěn)定,但在pH值大于7.5時(shí),會(huì)緩慢水解并失去其對(duì)巰基的反應(yīng)特異性。由于這些原因,涉及這種類型的異雙官能交聯(lián)劑的共扼實(shí)驗(yàn)通常在pH7.2-7.5下進(jìn)行,與NHS-酯(胺靶向)反應(yīng)之前或與馬來酰亞胺(巰基靶向) 反應(yīng)同時(shí)完成。  

6. 4-琥珀酰亞胺氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯 SMPT

圖 6  SMPT分子結(jié)構(gòu)

SMPT 是一種長鏈交聯(lián)劑,可以通過 NHS 酯和吡啶基二硫基反應(yīng)性基團(tuán)與半胱氨酸巰基形成強(qiáng)(位阻)但可切割(可還原)二硫鍵,實(shí)現(xiàn)胺與巰基的偶聯(lián)。SMPT常用于將毒素分子與針對(duì)細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體偶聯(lián)。SMPT產(chǎn)生的這些免疫毒素具有很強(qiáng)的殺傷力,因?yàn)榕c沒有可切割鍵的結(jié)合物(如SPDP)相比,可切割的二硫鍵具有更大的細(xì)胞毒性。此外,在間隔臂中的吡啶-2-硫酮旁邊是苯環(huán)和與阻礙二硫鍵的碳相鄰的甲基,允許在體內(nèi)特殊的共扼穩(wěn)定性。SMPT具有比其他NHS交聯(lián)劑在水溶液中更穩(wěn)定的水解的額外好處。  

7. 琥珀酰亞胺基(4-碘乙?;?氨基苯甲酸酯 SIAB


圖 7  SIAB分子結(jié)構(gòu)

SIAB 是一種中等長度 (10.6 ?) 的交聯(lián)劑,可以通過 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 酯和碘乙酰反應(yīng)性基團(tuán)實(shí)現(xiàn)胺與巰基的偶聯(lián)。Sulfo-SIAB是以鈉鹽的形式存在的,水溶性約為10mM。SIAB必須首先溶解在有機(jī)溶劑中,如DMSO或DMF,然后添加到反應(yīng)混合物中。SIAB是親脂性的,膜滲透性的,不具有帶電基團(tuán)。  

8. N-琥珀酰亞胺 S-乙酰巰基乙酸酯 SATA)

圖 8  SATA分子結(jié)構(gòu)

SATA 是一種短鏈(2.8 ?)試劑,用于伯胺的共價(jià)修飾以及添加受保護(hù)但可暴露的巰基,能夠?qū)崿F(xiàn)異型雙功能交聯(lián)。在溫和條件下可使硫醇去保護(hù)。通常在pH為7.5時(shí)引發(fā)耦合反應(yīng),通過酰胺鍵生成含伯胺的分子。在中性pH時(shí)可與0.05M羥胺發(fā)生去保護(hù)反應(yīng)。用于制備酶免疫交聯(lián)劑和半抗原載體分子偶聯(lián)物。SATA中間臂鏈接PEG相比普通-CH2-具有更佳的水溶性;更好的避免蛋白聚集。  

9. S-乙酰巰基丁二酸酐 SAMSA


圖 9  SAMSA分子結(jié)構(gòu)

S-乙酰巰基丁二酸酐是一種胺反應(yīng)性試劑,含有巰基。當(dāng)被胺親核試劑攻擊時(shí),酸酐區(qū)域打開,形成胺鍵。但是,在該開環(huán)反應(yīng)過程中,形成了游離的羧酸根基團(tuán),使分子帶負(fù)電。電荷逆轉(zhuǎn)影響蛋白質(zhì)的活性和分子的構(gòu)象。



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