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磁珠法RNA pull-down 的經(jīng)典操作流程

來源:生物磁珠專家 2018-12-22 11:37:29??????點(diǎn)擊:



采用鏈霉親和素磁珠(PuriMag G-strep 貨號(hào)PMG015)進(jìn)行RNA pull-down 

RNA pull-down assay using Streptavidin magnetic beads 


1. RNA pull-down 第一天——生物素探針標(biāo)記RNA

1)前期準(zhǔn)備:取出Pierce? RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit,將試劑盒中的PEG及DMSO置于常溫,其余組分置于冰上融化,也可將PEG放于37攝氏度融化;打開PCR儀;

2)依照RNA母管含量,用DEPC水溶解RNA,我們通常是10ug/管,用10μl DEPC水溶解。同時(shí)溶解試劑盒中Control RNA作為陰性對(duì)照;

3)取對(duì)照RNA及目標(biāo)RNA各5 μl,放于200 μl的PCR管中,每管可加1 μl DMSO,混勻后置于PCR儀上,85℃,5min,然后立即置于冰上5min;(DMSO的加入可有助于打開RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),提高RNA ligation的效率)

4)按照下表配制探針標(biāo)記反應(yīng)的體系:

成分                                                  體積(μl)    

water                                                         3
10X RNA ligase recation buffer                      3
RNase inhibitor                                           1
Non-labeled RNA                                         5

Biotinylated Cytidine Bisphosphate                1
T4 RNA Ligase                                            2
PEG 30%                                                  15
Total                                                        30

5)混勻上述反應(yīng)體系,之后放至PCR儀內(nèi), 16℃,4h至過夜。反應(yīng)時(shí)間的延長可提高連接效率;

6)連接反應(yīng)結(jié)束后,向每管加400μl nuclease free-water;

7)每管加300 μl酚氯仿提取標(biāo)記成功的RNA;渦旋后最大轉(zhuǎn)速離心15min,小心將上層水相移取到新的EP管中;

8)加10 μl 5M NaCl ,2 μl糖原,以及600 μl 預(yù)冷的100%乙醇,放于-20℃或-80℃沉淀,可沉淀過夜。


2. RNA pull-down 第二天


1)前期準(zhǔn)備

·DTT ,蛋白三聯(lián)室溫溶解;
·streptavidin magnetic beads;(PuriMag G-strep磁珠)
·RNase Inhibitor;
·細(xì)胞,10cm大皿若干,長至約80~90%密度;

2)RNA抽提

a)將沉淀過夜的RNA取出,4℃,最大轉(zhuǎn)速離心30min,離心后可見管底的白色沉淀,及為RNA;

b)小心移取上清,用1ml 70%乙醇洗滌,8000rpm 離心10min,之后吸凈管內(nèi)液體,空氣中晾干RNA,若乙醇未揮發(fā)完全,將影響下游實(shí)驗(yàn)效率;

c)每管加20 μl nuclease free-water溶解RNA,之后將RNA放于PCR儀中,95℃,5min使其變性,之后立即置于冰上,備用。

3)細(xì)胞裂解

a)棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS洗3次,吸去上清;

b)每個(gè)大皿中加入200μl cell lysis buffer A (加蛋白三聯(lián));

c)用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞,收集至EP管,液氮中三凍三融;

d)離心,4℃,3000rpm,離心10min;

e)轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中,置于冰上;可加200U/ml RNase Inhibitor;

f)取10-20 μl左右上清至新管中,作為實(shí)驗(yàn)input組。


4)magnetic beads (PuriMag G-strep 貨號(hào)PMG015預(yù)處理

a)渦旋混勻beads;

b)每管取400μl beads(如本次實(shí)驗(yàn)中,control RNA 及目的RNA各1管),置于磁力架上,吸去上清;

c)用800μl 1X binding & washing buffer ,洗3次,吸去上清;


5)RNA 與beads結(jié)合

a)向上一步的beads中加入400μl 2X binding & washing buffer;

b)向上一步中加入20μl RNA ,再補(bǔ)380μl DEPC水,使其終體積為800μl;

c)室溫慢速旋轉(zhuǎn)20min,使beads與RNA充分結(jié)合;

d)將上一步的管子置于磁力架上,吸去上清;

e)用800μl 1X binding & washing buffer(含RNase Inhibitor, 1U/ μl),洗3次,吸去上清;

f)用cell lysis buffer A 洗一次beads, 吸去上清,注意不要讓beads干掉。


6)RNA與蛋白相互作用

a)向上一步已處理好的beads中每管加入500μl 細(xì)胞裂解液(第3步);同時(shí)向每管加入RNase Inhibitor, 1U/ μl;

b)4℃慢速旋轉(zhuǎn)2h,使beads與細(xì)胞裂解液充分結(jié)合;

c)磁力架上吸去上清,用400 μl新鮮配制的cell lysis buffer A(+RNase Inhibitor+蛋白三聯(lián)),洗5次beads;

d)吸去上清,用25μl預(yù)冷的0.1% SDS溶液重懸beads,加6.25μl 的5X蛋白上樣緩沖液,100℃金屬浴煮10min.之后立即置于冰上5min,再置于磁力架上吸取上清至新的EP管中,準(zhǔn)備蛋白上樣。


7)蛋白的檢測(cè)

可采用western blot 或質(zhì)譜繼續(xù)下游蛋白的驗(yàn)證。

以上就是的RNA pull-down技術(shù)的超詳細(xì)秘籍啦!


用于pull-down的鏈霉親和素磁珠請(qǐng)參考:

 http://www.5000js.com/Product/8271042221.html (200nm鏈霉親和素磁珠)

http://www.5000js.com/Product/9728163513.html (1um鏈霉親和素磁珠)

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