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貨號(hào)
規(guī)格
MS-TIM001
1 ml
MS-TIM010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-IMAC-Ti（使用鈦離子作為固定化金屬親和層析）是一種專(zhuān)有的磁性聚合物微球載體，提供簡(jiǎn)單、方便、高效的磷酸肽富集方法，例如胰蛋白酶消化的蛋白質(zhì)混合物。該產(chǎn)品利用聚合物技術(shù)的卓越特性，將鈦離子（Ti4+）螯合到聚合物微球MagStart上，設(shè)計(jì)了一種高度特異性富集磷酸肽的產(chǎn)品，適用于基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用。與MagReSyn?-Ti-IMAC有等同效果。
MagStart-IMAC-Ti微粒極高的官能團(tuán)密度為生物分子偶聯(lián)提供了高濃度的反應(yīng)位點(diǎn)。MagStart-IMAC-Ti的高結(jié)合載量允許減少高活性功能微粒的體積來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)方案小型化，進(jìn)而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應(yīng)用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過(guò)磁壓縮減少了洗滌和洗脫過(guò)程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強(qiáng)磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Isolation and purification of phosphopeptides
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Ti4+
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 2.5~12, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當(dāng)儲(chǔ)存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. 結(jié)合和洗脫流程
可能影響磷酸肽結(jié)合的因素包括緩沖液組成和pH值，以及DNA或其他干擾化合物等污染物的存在。超聲處理可能不足以降解 DNA，建議在裂解物中降解 DNA（e.g. Benzonase?）。我們建議在富集前對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽，以去除干擾化合物，例如使用Waters Sep-Pak C18或Oasis HLB濾芯。所需的磁珠數(shù)量可能需要根據(jù)您的應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化，主要是多肽：磁珠比例，以確保最佳回收率和特異性。
注意：所有試劑都應(yīng)是新鮮制備的分析級(jí)，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法和緩沖溶液僅供參考，無(wú)意限制。MagStart-IMAC-Ti 與一系列不同的磷酸肽富集緩沖液兼容?？蓪?shí)現(xiàn)的純度和產(chǎn)量取決于實(shí)驗(yàn)條件，應(yīng)針對(duì)每個(gè)特定應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化。
2.1. MagStart-IMAC-Ti的平衡
MagStart-IMAC-Ti 以 20 mg/ml懸浮于20% 乙醇中形式提供，使用前需要去除運(yùn)輸溶液，并在結(jié)合緩沖液中平衡微粒。每個(gè)反應(yīng)需要至少20μl磁珠懸浮液以確保手動(dòng)吸取和自動(dòng)化方案中的磁珠沉淀的量。目前的方案足以從~500μg總蛋白消化物中純化磷酸肽?？赏ㄟ^(guò)對(duì)當(dāng)前協(xié)議進(jìn)行以下調(diào)整來(lái)適應(yīng)起始蛋白：
Protein Digest
Bead Quantity
Ratio of Beads/Peptide
Equilibration volume (μl)
Wash volume (μl)
20 μg
20μl: 0.4mg
20
200
100
50 μg
8
100 μg
4
200 μg
40μl: 0.8mg
500 μg
100μl: 2mg
1 mg
200μl: 4mg
2 mg
400μl: 8mg
400
注意：雖然這是推薦的方案，但富集可能取決于樣品。例如：對(duì)于磷酸肽豐度低的樣品，您可以降低微珠與蛋白質(zhì)的比率（即，將 1 mg 微珠用于 500 μg 蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)：微珠比例為 1：2）。理想的比率應(yīng)該是基于樣品經(jīng)驗(yàn)性的。
1） 通過(guò)渦旋混合或倒置徹底重懸 MagStart-IMAC-Ti，以確保磁珠均勻的懸浮。
2） 將100 μl 的MagStart-IMAC-Ti（2 mg 珠子，蛋白與珠子比例為1：4）轉(zhuǎn)移到2 ml離心管中。
3） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清。
4） 移除上清運(yùn)輸保存液。
5） 加入200 μl Loading Buffer （0.1 M glycolic acid in 80% ACN, 5%TFA），平衡60秒。
注意：調(diào)節(jié)glycolic acid濃度對(duì)富集結(jié)合容量、特異性和選擇性（如單磷酸化多肽和多磷酸化多肽）有影響。在進(jìn)行大規(guī)模富集效率研究前，建議根據(jù)樣本來(lái)源和純度評(píng)估glycolic acid濃度范圍，以獲得最優(yōu)結(jié)果。
6） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除Loading Buffer。
7） 重復(fù)步驟5和6兩次，共進(jìn)行三次平衡。
8） 移除Loading Buffer后，MagStart-IMAC-Ti可直接用于目標(biāo)磷酸肽的結(jié)合。
2.2. 磷酸化多肽富集流程
1） 將500 μg脫鹽蛋白在200 μl Loading buffer中酶解和混勻。
2） 4℃下10000×g離心5分鐘移除不溶物。
3） 將上清液轉(zhuǎn)移到2.1步驟準(zhǔn)備好的MagStart-IMAC-Ti磁珠中。
4） 渦旋或移液槍上下吹打混勻磁珠。
5） 在室溫孵育20分鐘確保磁珠樣本充分互作。
6） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
7） 加入100 μl的Loading buffer輕輕攪動(dòng)2分鐘，以洗去未結(jié)合的的樣本。
8） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
9） 加入100 μl的Wash buffer 1 （80% ACN和1% TFA水溶液）輕微吹打2分鐘，重選洗去非特異性結(jié)合的多肽。
10） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
11） 加入100 μl Wash buffer 2 （10% ACN和0.2% TFA水溶液）再輕微吹打2分鐘洗滌磁珠。
12） 加入150 μl Elution buffer（1% NH4OH）持續(xù)輕微混勻10分鐘，洗脫磁珠結(jié)合的磷酸多肽。
13） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清。
14） 將含磷酸多肽的洗脫上清液轉(zhuǎn)移到低蛋白吸附的離心管中（含50μl的10% Formic Acid）。
15） 重復(fù)12-14步驟以提高回收率。
16） 將所有洗脫液合并成得400 μl。
17） 凍干或真空干燥洗脫液（-80℃處理30分鐘）。
18） 質(zhì)譜分析樣品。分析前可通過(guò)C18 SPE柱除鹽或在線C18除鹽濃縮后進(jìn)行液質(zhì)分析。
2.3. 推薦緩沖液
Loading buffer: 0.1 M glycolic acid in 80% acetonitrile (ACN), 5% trifluoroacetic acid (TFA)
Wash buffer 1: 80% ACN, 1% TFA
Wash buffer 2: 10% ACN, 0.2% TFA
Elution buffer: 1% NH4OH
3. 常見(jiàn)問(wèn)題
問(wèn)題
可能原因
改善方法
配體未按預(yù)期與微粒結(jié)合
反應(yīng)時(shí)間不夠
延長(zhǎng)孵育時(shí)間到30分鐘
樣品或溶液中的干擾物阻止結(jié)合
DNAse酶和脫鹽處理以移除潛在的干擾物
微粒數(shù)量不足
增加顆粒的數(shù)量
非特異性結(jié)合多肽
磷酸化多肽結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)不足
增加結(jié)合液中glycolic acid濃度或降低磁珠/蛋白比例
洗滌體積不夠
增加洗滌液體積到高至500μl
洗滌時(shí)間不夠
增加洗滌時(shí)間
嘗試替換洗滌液
Wash buffer 1: 60% ACN, 1% TFA, 200mM NaCl；
Wash buffer 2: 60% ACN, 1% TFA
低磷酸化多肽回收
嘗試替換洗脫液
確認(rèn)NH4OH濃度為1%。增加到4%，并加入CAN至終濃度為40%。
對(duì)樣本重新使用磁珠
將2.2中步驟6的上清保留并重新與磁珠孵育。
濃縮倍數(shù)不夠
質(zhì)譜前凍干濃縮樣品。
低于預(yù)期質(zhì)譜信號(hào)
脫鹽。降低洗脫時(shí)間。
TMT標(biāo)簽應(yīng)用中低回收
與樣本或試劑不相容
請(qǐng)參考產(chǎn)品引用
客戶(hù)發(fā)表論文：
1. Gongzhen Liu, et al. Proteomics and phosphoproteomics reveal novel proteins involved in Cipangopaludina chinensis carcasses. Front. Chem., 29 August 2024, Sec. Analytical Chemistry, Volume 12 - 2024 | https://doi.org/10.3389/fchem.2024.1416942 (TiO2磁珠和IMAC-Ti磁珠用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析)
2. Koenig C, Martinez-Val A, Naicker P, et al. Protocol for high-throughput semi-automated label-free-or TMT-based phosphoproteome profiling[J]. STAR protocols, 2023, 4(3): 102536.
3. Martínez-Val A, Fort K, Koenig C, et al. Hybrid-DIA: intelligent data acquisition integrates targeted and discovery proteomics to analyze phospho-signaling in single spheroids[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 3599.
4. Khozooei S, Lettau K, Barletta F, et al. Fisetin induces DNA double-strand break and interferes with the repair of radiation-induced damage to radiosensitize triple negative breast cancer cells[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2022, 41(1): 256.
5. Billing A M, Kim Y C, Gullaksen S, et al. Metabolic communication by SGLT2 inhibition[J]. Circulation, 2024, 149(11): 860-884.
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