一、概述
His-Tag 蛋白純化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）針對純化 His 標(biāo)簽蛋白而研制的一種新型純化介質(zhì)，具有高效、快速、方便等特點，可通過磁分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標(biāo)蛋白，極大地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業(yè)領(lǐng)域便捷地進(jìn)行 His-tag 蛋白的純化。
二、產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱
Magarose-IDA/NTA/TED
貨號
PMAG001-1/001-2/001-3
磁珠濃度
25%（v/v）in 20% 乙醇
配基及密度
IDA or NTA or TED
介質(zhì)
6%交聯(lián)磁性瓊脂糖
粒徑
20-45μm
配體結(jié)合
30-40mg融合蛋白/ml磁珠
保存
2~8℃保存一年
注：IDA結(jié)合容量高，耐螯合劑差；NTA結(jié)合容量較高，耐螯合劑較好；TED結(jié)合容量低，耐螯合劑優(yōu)異。
三、使用方法
1. 推薦的緩沖液
A. 可溶性His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方
Binding Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 5~20mM咪唑, pH7.4;
Wash Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 20~100mM咪唑, pH7.4;
Elution Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 300-500mM咪唑, pH7.4;
B. 包涵體His標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方
Binding Buffer: 8M Urea, 50mM NaH2PO4, 100mM Tris·HCl, pH8.0;
Wash Buffer: 8M Urea, 50 mM NaH2PO4, 100 mM Tris·HCl, pH6.3;
Elution Buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH2PO4, 100mM Tris·HCl, 300-500 mM 咪唑, pH4.5;
Note: Buffer 在使用前需 0.22或0.45 μm濾膜過濾除菌。推薦Buffer 體系適用于多數(shù)His標(biāo)簽蛋白的純化，在 Binding Buffer 中添加一定濃度咪唑可降低非特異性結(jié)合，提高目的蛋白純度。初次使用可采用推薦的緩沖液，再根據(jù)實驗結(jié)果適當(dāng)調(diào)整緩沖液中的咪唑濃度。
2. 樣品準(zhǔn)備
2.1組氨酸標(biāo)簽蛋白樣品準(zhǔn)備（在大腸桿菌下非變性條件下可溶性表達(dá)）
稀釋重組表達(dá)的蛋白：每克大腸桿菌菌體加入5~10 ml binding buffer重懸。樣品和binding buffer含同樣濃度的咪唑可避免宿主細(xì)胞表達(dá)的含組氨酸的蛋白。同時要去除大顆粒和高濃度的螯合劑，如EDTA，組氨酸、檸檬酸等雜質(zhì)，防止破壞Ni-NTA磁珠。
1. 酶解：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 μg/ml DNase，1 mM MgCl2，1 mM PMSF（終濃度）或其他蛋白酶抑制劑。加入的抑制劑須對磁珠無影響，4°C混勻30分鐘。
2. 機械裂解：超聲，均質(zhì)，反復(fù)凍融等。
3. 調(diào)整裂解液的pH到7.4：不要用強堿或酸調(diào)節(jié)pH（防止沉淀）。
4. 裂解液離心：將液體轉(zhuǎn)移到離心管中在室溫或4°C 12000 rpm離心20 min，溫度選擇取決于蛋白穩(wěn)定性。
5. 收集上清或收集離心后沉淀準(zhǔn)備下一步實驗。
6. 對于在酵母、昆蟲及哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀。用1× PBS透析，加入到磁珠中，如樣品中不含EDTA、組氨酸、檸檬酸等影響磁珠的成分，可直接純化。
2.2組氨酸標(biāo)簽蛋白樣品準(zhǔn)備（在大腸桿菌中包涵體表達(dá)變性條件純化）
1. 用1×PBS懸浮細(xì)胞（每ml細(xì)菌沉淀約5 ml 1× PBS），按照上面的超聲條件進(jìn)行實驗。
2. 裂解液在12,000 rpm離心10 min收集包涵體。用1×PBS洗滌幾次包涵體。
3. 用Binding/Wash buffer溶解包涵體（每ml包涵體約5 ml Buffer），并在室溫下孵育30~60 min?？赡苄枰|(zhì)或超聲將沉淀完全溶解。
4. 12,000 rpm離心30 min去除不溶物。小心的將上清轉(zhuǎn)移到干凈的管中而不觸碰下面的沉淀。
2.3組氨酸標(biāo)簽蛋白純化步驟
磁珠使用量由用戶根據(jù)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量和磁珠載量計算獲得，這里以5-10mg目標(biāo)蛋白為例：
1. 磁珠準(zhǔn)備：將Ni-NTA磁珠充分混勻，使用移液器取2 ml 的磁珠懸浮液，（磁珠沉降體積500μl）置于離心管中，磁分離，待溶液澄清，吸棄清液，加入ddH2O反復(fù)清洗，去除酒精。
2. 磁珠平衡：加入5 ml Binding Buffer，反復(fù)吹打5-10次，磁分離，吸棄清液，重復(fù)洗2次。
3. 磁珠與目的蛋白結(jié)合：用10 ml Binding Buffer懸浮2 g濕菌體，破胞后即為目的蛋白粗樣，將粗蛋白加入磁珠，顛倒混勻。室溫孵育15 min（如目標(biāo)蛋白不穩(wěn)定，2-8°C下孵育30 min）。
4. 洗雜：置離心管于磁分離器，移出上清液，保留以備取樣檢測。向離心管中加入10 ml Wash Buffer，吹打5-10次，磁分離，吸取上清液，保留以備檢測。重復(fù)洗雜步驟3次以上。
5. 洗脫：用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度，加入2-10 ml Elution Buffer 加入到離心管中，重懸磁珠，磁分離，吸取上清液，即為目的蛋白組分。重復(fù)上述步驟多次，分別收集洗脫組分并留樣檢測，以提高目的蛋白回收量。
6. 磁珠后處理：加入5 ml Elution Buffer，重懸磁珠，磁分離，吸棄上清，重復(fù)該步驟2次。再用5 ml ddH2O反復(fù)清洗3-5次。最后，加入2 ml 20%的乙醇溶液，使總體積等于初始磁珠懸浮液體積，保存于2-8°C。
7. SDS-PAGE檢測：純化樣品SDS-PAGE 檢測。
8. 磁珠再生：磁珠連續(xù)使用三次以上，其結(jié)合目標(biāo)蛋白能力會降低，建議進(jìn)行磁珠再生處理。
Stripping Buffer: 20 mM Sodium Phosphate, 500 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7.4
Washing Buffer（可選）: 0.5 M NaOH, 2 M NaCl
Recharge Buffer: 100 mM NiSO4（該化學(xué)試劑有一定的毒性，可能造成過敏反應(yīng)，使用時務(wù)必注意）以5 mL 10%（v/v）磁珠懸液為例，詳細(xì)說明磁珠再生操作：
1) 將磁珠懸液磁分離，去除上清，離心管中加入5 mL ddH2O，重懸磁珠，磁分離去上清。
2) 加入5 mL Stripping Buffer，重懸磁珠，室溫混旋5 min，磁分離，去上清。重復(fù)此步驟1次。
3) 加入5 mL ddH2O，重懸磁珠，磁分離去上清，重復(fù)此步驟 2次。
4) 堿處理：加入5 mL Washing Buffer，重懸磁珠，室溫旋混5 min，磁分離，去上清。加入5 mL ddH2O，重懸磁珠，磁分離，去上清。ddH2O重復(fù)洗3~5次，至洗滌液中性。
5) 加入5 mL Recharge Buffer，重懸磁珠，室溫旋混20 min，磁性離，去除上清液。
6) 加入5 mL ddH2O，重懸磁珠，磁性離，去上清。重復(fù)此步驟4次以上，保證鎳離子去除完全。
7) 加入2ml 20%的乙醇溶液，使總體積等于初始磁珠懸浮液的體積，保存于2-8°C。
3．注意事項
1) 磁珠使用和保存過程中避免冷凍、干燥和高速離心；
2) 使用產(chǎn)品前務(wù)必充分振蕩使磁珠均勻懸浮；
3) 磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉(zhuǎn)離心管重懸磁珠，可采用移液器反復(fù)吹吸或短時漩混使磁珠充分重懸；
4) 用戶可根據(jù)實際需要保留經(jīng)磁分離移去的上清，進(jìn)行檢測分析；
5) 本產(chǎn)品重復(fù)使用時建議純化同種蛋白，純化不同蛋白時，建議使用新磁珠；
6) 本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；
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