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貨號(hào)
規(guī)格
MS-ZRM001
1 ml
MS-ZRM010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-IMAC-Zr（使用鈦離子作為固定化金屬親和層析）是一種專有的磁性聚合物微球載體，提供簡(jiǎn)單、方便、高效的磷酸肽富集方法，例如胰蛋白酶消化的蛋白質(zhì)混合物。該產(chǎn)品利用聚合物技術(shù)的卓越特性，將鈦離子（Ti4+）螯合到聚合物微球MagStart上，設(shè)計(jì)了一種高度特異性富集磷酸肽的產(chǎn)品，適用于基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用。與MagReSyn?-Zr-IMAC有等同效果。
MagStart-IMAC-Zr微粒極高的官能團(tuán)密度為生物分子偶聯(lián)提供了高濃度的反應(yīng)位點(diǎn)。MagStart-IMAC-Zr的高結(jié)合載量允許減少高活性功能微粒的體積來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)方案小型化，進(jìn)而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應(yīng)用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過(guò)磁壓縮減少了洗滌和洗脫過(guò)程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強(qiáng)磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Isolation and purification of phosphopeptides
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Zr4+
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 2.5~12, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當(dāng)儲(chǔ)存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. 結(jié)合和洗脫流程
可能影響磷酸肽結(jié)合的因素包括緩沖液組成和pH值，以及DNA或其他干擾化合物等污染物的存在。超聲處理可能不足以降解 DNA，建議在裂解物中降解 DNA（e.g. Benzonase?）。我們建議在富集前對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽，以去除干擾化合物，例如使用Waters Sep-Pak C18或Oasis HLB濾芯。所需的磁珠數(shù)量可能需要根據(jù)您的應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化，主要是多肽：磁珠比例，以確保最佳回收率和特異性。
注意：所有試劑都應(yīng)是新鮮制備的分析級(jí)，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法和緩沖溶液僅供參考，無(wú)意限制。MagStart-IMAC-Zr 與一系列不同的磷酸肽富集緩沖液兼容?？蓪?shí)現(xiàn)的純度和產(chǎn)量取決于實(shí)驗(yàn)條件，應(yīng)針對(duì)每個(gè)特定應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化。
2.1. MagStart-IMAC-Zr的平衡
MagStart-IMAC-Zr 以 20 mg/ml懸浮于20% 乙醇中形式提供，使用前需要去除運(yùn)輸溶液，并在結(jié)合緩沖液中平衡微粒。每個(gè)反應(yīng)需要至少20μl磁珠懸浮液以確保手動(dòng)吸取和自動(dòng)化方案中的磁珠沉淀的量。目前的方案足以從~500μg總蛋白消化物中純化磷酸肽?？赏ㄟ^(guò)對(duì)當(dāng)前協(xié)議進(jìn)行以下調(diào)整來(lái)適應(yīng)起始蛋白：
Protein Digest
Bead Quantity
Ratio of Beads/Peptide
Equilibration volume (μl)
Wash volume (μl)
20 μg
20μl: 0.4mg
20
200
100
50 μg
8
100 μg
4
200 μg
40μl: 0.8mg
500 μg
100μl: 2mg
1 mg
200μl: 4mg
2 mg
400μl: 8mg
400
注意：雖然這是推薦的方案，但富集可能取決于樣品。例如：對(duì)于磷酸肽豐度低的樣品，您可以降低微珠與蛋白質(zhì)的比率（即，將 1 mg 微珠用于 500 μg 蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)：微珠比例為 1：2）。理想的比率應(yīng)該是基于樣品經(jīng)驗(yàn)性的。
1） 通過(guò)渦旋混合或倒置徹底重懸 MagStart-IMAC-Zr，以確保磁珠均勻的懸浮。
2） 將100 μl 的MagStart-IMAC-Zr（2 mg 珠子，蛋白與珠子比例為1：4）轉(zhuǎn)移到2 ml離心管中。
3） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清。
4） 移除上清運(yùn)輸保存液。
5） 加入200 μl Loading Buffer （0.1 M glycolic acid in 80% ACN, 5%TFA），平衡60秒。
注意：調(diào)節(jié)glycolic acid濃度對(duì)富集結(jié)合容量、特異性和選擇性（如單磷酸化多肽和多磷酸化多肽）有影響。在進(jìn)行大規(guī)模富集效率研究前，建議根據(jù)樣本來(lái)源和純度評(píng)估glycolic acid濃度范圍，以獲得最優(yōu)結(jié)果。
6） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除Loading Buffer。
7） 重復(fù)步驟5和6兩次，共進(jìn)行三次平衡。
8） 移除Loading Buffer后，MagStart-IMAC-Zr可直接用于目標(biāo)磷酸肽的結(jié)合。
2.2. 磷酸化多肽富集流程
1） 將500 μg脫鹽蛋白在200 μl Loading buffer中酶解和混勻。
2） 4℃下10000×g離心5分鐘移除不溶物。
3） 將上清液轉(zhuǎn)移到2.1步驟準(zhǔn)備好的MagStart-IMAC-Zr磁珠中。
4） 渦旋或移液槍上下吹打混勻磁珠。
5） 在室溫孵育20分鐘確保磁珠樣本充分互作。
6） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
7） 加入100 μl的Loading buffer輕輕攪動(dòng)2分鐘，以洗去未結(jié)合的的樣本。
8） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
9） 加入100 μl的Wash buffer 1 （80% ACN和1% TFA水溶液）輕微吹打2分鐘，重選洗去非特異性結(jié)合的多肽。
10） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
11） 加入100 μl Wash buffer 2 （10% ACN和0.2% TFA水溶液）再輕微吹打2分鐘洗滌磁珠。
12） 加入150 μl Elution buffer（1% NH4OH）持續(xù)輕微混勻10分鐘，洗脫磁珠結(jié)合的磷酸多肽。
13） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清。
14） 將含磷酸多肽的洗脫上清液轉(zhuǎn)移到低蛋白吸附的離心管中（含50μl的10% Formic Acid）。
15） 重復(fù)12-14步驟以提高回收率。
16） 將所有洗脫液合并成得400 μl。
17） 凍干或真空干燥洗脫液（-80℃處理30分鐘）。
18） 質(zhì)譜分析樣品。分析前可通過(guò)C18 SPE柱除鹽或在線C18除鹽濃縮后進(jìn)行液質(zhì)分析。
2.3. 推薦緩沖液
Loading buffer: 0.1 M glycolic acid in 80% acetonitrile (ACN), 5% trifluoroacetic acid (TFA)
Wash buffer 1: 80% ACN, 1% TFA
Wash buffer 2: 10% ACN, 0.2% TFA
Elution buffer: 1% NH4OH
3. 常見(jiàn)問(wèn)題
問(wèn)題
可能原因
改善方法
配體未按預(yù)期與微粒結(jié)合
反應(yīng)時(shí)間不夠
延長(zhǎng)孵育時(shí)間到30分鐘
樣品或溶液中的干擾物阻止結(jié)合
DNAse酶和脫鹽處理以移除潛在的干擾物
微粒數(shù)量不足
增加顆粒的數(shù)量
非特異性結(jié)合多肽
磷酸化多肽結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)不足
增加結(jié)合液中glycolic acid濃度或降低磁珠/蛋白比例
洗滌體積不夠
增加洗滌液體積到高至500μl
洗滌時(shí)間不夠
增加洗滌時(shí)間
嘗試替換洗滌液
Wash buffer 1: 60% ACN, 1% TFA, 200mM NaCl；
Wash buffer 2: 60% ACN, 1% TFA
低磷酸化多肽回收
嘗試替換洗脫液
確認(rèn)NH4OH濃度為1%。增加到4%，并加入CAN至終濃度為40%。
對(duì)樣本重新使用磁珠
將2.2中步驟6的上清保留并重新與磁珠孵育。
濃縮倍數(shù)不夠
質(zhì)譜前凍干濃縮樣品。
低于預(yù)期質(zhì)譜信號(hào)
脫鹽。降低洗脫時(shí)間。
TMT標(biāo)簽應(yīng)用中低回收
與樣本或試劑不相容
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