一、概述
Magarose-ProA（ProG、ProA/G、ProL）抗體純化磁珠系列產(chǎn)品是由NHS活化的磁性瓊脂糖微球與Protein A（or Protein G）共價結(jié)合形成的復合微粒。與當前國際免疫磁珠市場上同類產(chǎn)品相比，該產(chǎn)品具有更高的抗體結(jié)合能力和較低的蛋白非特異吸附率，洗脫條件更均一，一步純化即可從血清樣品中分離出純度大于90%的抗體。本產(chǎn)品為微米級磁性微球，熟練操作可在15 min內(nèi)完成抗體吸附過程，30 min內(nèi)完成抗體純化流程。本產(chǎn)品可重復使用，適用于血漿、腹水、組織培養(yǎng)上清液等樣品中的抗體純化，也可用于抗體固定及其它相關(guān)研究。用戶可根據(jù)目標抗體的種屬來源及亞型選擇磁珠的類別，Magarose-ProA（roG、ProA/G、ProL）磁珠與不同抗體的親和性比較參見http://www.5000js.com/html/4309815423.html。
二、產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱
Magarose-ProA （ProG、ProA/G、ProL）
貨號
PMAG008
磁珠濃度
25% (v/v) in PBST（含0.05% NaN3）
配基密度
/
介質(zhì)
6%交聯(lián)磁性瓊脂糖
粒徑
20-45μm
配體結(jié)合
~40 mg Human IgG /ml磁珠
保存
2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白結(jié)合量與目標蛋白特性相關(guān)，此處僅作參考值。
三、緩沖液
Binding/Washing buffer PBST（pH 7.2~7.4）: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2.0 mM KH2PO4, 0.1% Tween-20;
NP40 Cell Lysis Buffer: 150mM NaCl, 1% NP40, 50mM Tris, pH 7.4
Elution buffer: 100mM Glycine, 0.1% Tween-20, pH 2.5;
Neutrilization buffer: 1.0 M Tris-HCl, pH 9.0;
四. 操作流程
1) 樣品處理
血清樣品處理：若目標蛋白豐度較高，建議用 Binding Buffer 稀釋樣品至目標蛋白終濃度為10~100 μg/mL，置于冰上備用（或-20℃長期保存）。
懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 500 g, 10 min），棄上清后稱重，按1.0×105個細胞20~30 μL的比例加PBS洗2次；按1.0×105個細胞20~30 μL的比例加NP40 Cell Lysis Buffer，同時加蛋白酶抑制劑（如終濃度1 mM的PMSF），混勻后于冰上處理 10min；離心收集上清（4℃，14000 g,10 min），置于冰上備用（或-20℃長期保存）。
貼壁細胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩次；用胰酶消化或者細胞刮刀，收集1.5 mL離心管內(nèi)，按1.0×105個細胞20~30 μL的比例加PBS洗滌2次；按1.0×105個細胞20~30 μL的比例加NP40 Cell Lysis Buffer，同時加蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），混勻后于冰上處理10min；離心收集上清（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上備用（或-20℃長期保存）。
大腸桿菌樣品處理：離心收集大腸桿菌（4℃, 12000 g, 2 min），棄上清后稱重，按每克（濕重）菌體10 mL的比例用PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5~10 mL 的比例加入Binding Buffer，同時加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），重懸菌體，超聲裂解細胞，離心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min）。
2) 磁珠預處理：將抗體純化磁珠漩渦振蕩30 s，充分重懸磁珠；取40 μL 25 %（v/v）磁珠懸液置于1.5 mL EP管中。磁分離，棄上清，用1 mL Binding/Washing buffer洗2次，磁分離，管中磁珠可直接用于抗體分離。注：該步磁珠用量可根據(jù)磁珠對目標抗體最大結(jié)合量進行調(diào)節(jié)。
3) 抗體吸附：
A. 用 100μLPBST 稀釋 2~20μg 抗體樣品，稀釋后加入磁珠離心管； 注：實際抗體使用量需根據(jù)實驗摸索，可參看磁珠對應(yīng)不同抗體亞型的親和力表；
B. 將上述混合物室溫混勻10~15分鐘；
C. 磁分離，去上清；100μLPBST 洗磁珠3 次。
4）抗原沉淀反應(yīng)
A. 抗原吸附：向上步裝有磁珠-抗體復合物的離心管加裂解液100~1000μL，移液槍吹打混勻；
B. 37℃顛倒混勻或者低速渦旋混勻 15~20 分鐘，使抗原和結(jié)合抗體的磁珠結(jié)合；
注：為使結(jié)合充分，孵育時間溫度可據(jù)實際需求調(diào)整；
C. 將上一步的離心管和混合物放入磁力架，吸取上清（上清可丟棄也可保存做后續(xù)分析）；
D. 取200μL PBS洗磁珠-抗體-抗原復合物3次；
E. 洗滌后用100μL PBS重懸磁珠，用于下一步。
注：抗原洗脫前將磁珠轉(zhuǎn)移新的離心管，避免將管壁上原有的非特異性吸附蛋白一起洗脫。
5）抗原洗脫
操作者根據(jù)后期檢測選擇抗原洗脫方法。
變性洗脫法： 將裝有磁珠-抗體-抗原復合物的離心管，磁分離去上清；向離心管中加入25μLElution Buffer和5μL 5x SDS-PAGE Loading Buffer（自備）重懸復合物； 95~100℃煮沸5~10分鐘；將煮沸后的離心管放入磁力架取上清做后續(xù)分析（注：上清液中含有抗原勿丟棄）。
非變性洗脫法： 將沉淀抗原第5步驟中的磁珠放入磁力架，磁分離去上清；向離心管中加入約30μL的Elution Buffer，用移液器輕輕混勻避免氣泡，顛倒混勻2~5分鐘；磁分離收集上清（注：上清液中含有抗原勿丟棄）；
中和：上述收集上清中抗原，若需做功能驗證需加入Neutralization Buffer（例：100μLElution Buffer加入10 μL Neutralization Buffer即可）。
6）Target Antigen Detection（沉淀后抗原分析）
A. 變性洗脫抗原適用方向
1. 蛋白染色鑒定； 2. Western blotting；3. SDS-PAGE for Fluorography
B. 非變性洗脫抗原適用方向
1. 蛋白特征分析；2. 免疫；3. 酶學研究；4. 氨基酸序列分析；5. 蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析
C. 未做洗脫抗原適用方向
1. 蛋白相互作用；2. 酶學研究；3. 生物分析；4. 免疫學分析
五. 磁珠再生
1. 磁珠多次使用后會有沉淀蛋白、強疏水蛋白、脂蛋白等雜質(zhì)非特異性吸附，為了保證磁珠使用效率，建議持續(xù)使用 5 次后進行磁珠再生。
2. 按約每 1 mL 10%（v/v） 磁珠加入 1 mL 1%（v/v）Triron X-100 磁珠再生緩沖液，振蕩均勻，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)混合，10 min 后進行磁性分離，棄上清液。
3. 立即加入 1 mL Binding/Washing buffer 進行重懸，然后磁分離，棄上清，重復該操作 3 次。
4. 加1 mL Storage buffer重懸磁珠，2~8℃保存。
六. 注意事項
1. 磁珠應(yīng)保存在儲存溶液中，防止干燥；
2. 請勿將磁珠冷凍或離心，以免不可逆聚集；
3. 為保證最佳的實驗結(jié)果，請選擇特異性較強的抗體進行免疫沉淀反應(yīng)；
4. 操作者根據(jù)實際需求，利用抗體及抗原結(jié)合反應(yīng)步驟中收集的上清液，檢測抗體、抗原和磁珠的結(jié)合情況；
5. 對于 IP 實驗，不同類型的抗體抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會受結(jié)合緩沖液和洗滌緩沖液的影響，因此，如操作者使用本方案的緩沖體系不能獲得很好的實驗結(jié)果，可自行篩選及配制緩沖液進行實驗；
6. 磁珠表面包被Protein A/G 在極端條件（如低 pH、加熱處理）存在極低蛋白脫落情況；
7. 不建議用于分子量約 130 kD 目標蛋白的免疫沉淀實驗。
3. 磁珠再生
1) 磁珠多次使用后會有沉淀蛋白、強疏水性蛋白、脂蛋白等雜質(zhì)非特異性吸附到磁珠上，為了保證磁珠的使用效率，建議持續(xù)使用5次后進行磁珠再生處理。
2) 按每1 mL 25%（v/v） 磁珠加入2 mL 1%（v/v）Triron X-100磁珠再生緩沖液，振蕩均勻，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)混合，10 min后進行磁性分離，棄上清液。
3) 立即加入1 mL Binding/Washing buffer進行重懸，然后磁性分離，棄上清液，重復該操作3次。
4) 加入1 mL Storage buffer重懸磁珠，2~8℃保存。
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