1. 概述
點(diǎn)擊化學(xué)描述了在溫和水溶液中快速選擇性地“點(diǎn)擊”反應(yīng)成對(duì)官能團(tuán)。 Click Chemistry 的概念已轉(zhuǎn)變?yōu)榉奖?、通用且可靠的分?A 和 B 的兩步偶聯(lián)程序，廣泛用于生物科學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和材料科學(xué)。
疊氮化物磁性納米微粒（PuriMagTM G-N3磁珠）是均一的、聚合物包覆的超順磁納米粒，親水表面確保磁珠在各種緩沖液中具有出色的分散性、低非特異吸附和易操作性，表面涂有高密度疊氮活性基團(tuán)。PuriMagTM G-N3磁珠是一種有效的磁性納米粒子，可通過Cu（I）催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成（CuAAC）或無Cu（I）的疊氮化物-DBCO通過CLICK反應(yīng)i共價(jià)捕獲功能化的蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白質(zhì)需要在代謝、酶促或化學(xué)上帶有炔烴標(biāo)記（Cu（I）催化反應(yīng)）或DBCO標(biāo)記（不含Cu（I）的反應(yīng)）。隨后，可以高度嚴(yán)格地洗滌含有共價(jià)連接的蛋白質(zhì)的疊氮化物磁珠，實(shí)際上消除了任何非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。獨(dú)特的表面意味著在基于蛋白質(zhì)的系統(tǒng)中低的非特異性結(jié)合，并且無需使用表面活性劑即可實(shí)現(xiàn)出色的處理效果。這些高結(jié)合力的磁珠適合在各種研究和診斷應(yīng)用中使用，無論您是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模還是對(duì)高通量應(yīng)用有更嚴(yán)格的要求。疊氮化物磁珠在有機(jī)溶劑和高尿素濃度中不穩(wěn)定。
特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)：
w 高結(jié)合能力；
w 快速、高效的偶聯(lián)；
w 親水性長臂間隔子，可將空間位阻和非特異性結(jié)合降至最低；
w 偶聯(lián)后表面沒有電荷；
w 穩(wěn)定的共價(jià)鍵，配體泄漏最少；
w 低非特異性結(jié)合；
w 1~20 mg蛋白質(zhì)或0.1~2mg肽/ g磁珠；
磁珠偶聯(lián)原理示意圖：
2. 產(chǎn)品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Azide group
Group density
~300 μmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in DI water
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
A. 所需材料
?t-butyl alcohol (t-BuOH) 12mL
?Dimethylsulfoxide (DMSO) 3mL
?Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine（TBTA） M.W. 530.63 2.7mg
?Copper(Ⅱ)sulfate（CuSO4） M.W. 159.61 16mg
?(＋)-Sodium L-ascorbate M.W. 198.11 20mg
?Methanol （MeOH） 4mL
B. 偶聯(lián)方法
為了進(jìn)行篩選，首先需要優(yōu)化配體在PuriMagTM磁珠上的固定量。您可以通過更改配體的濃度來更改配體的固定量。該實(shí)驗(yàn)方案顯示了一種將配體固定在疊氮化物磁珠上時(shí)以0μM，5μM，25μM和125μM四種不同濃度固定配體的方法。
B-1. 解決方案的準(zhǔn)備
1）通過將12mL的t-BuOH與3mL的DMSO混合來制備15mL的t-BuOH / DMSO溶液（t-BuOH：DMSO = 4：1）
2）將配體（化合物）溶解在t-BuOH / DMSO溶液中，并制備200μL的500μM配體溶液。
3）將2.7mg TBTA溶于1mL的t-BuOH / DMSO溶液中，并準(zhǔn)備1mL的5mM TBTA溶液。將190μL的t-BuOH / DMSO溶液添加到10μL的5mM TBTA中，并準(zhǔn)備200μL的250μMTBTA溶液。
4）將16mg的CuSO4溶于1mL的超純水中，并準(zhǔn)備1mL的100mM CuSO4溶液。將190μL超純水添加到10μL的100mM CuSO4溶液中，并準(zhǔn)備200μL的5mM CuSO4溶液。
5）將20mg（+）-L-抗壞血酸鈉溶解在1mL超純水中，并準(zhǔn)備1mL 100mM（+）-L-抗壞血酸鈉溶液。向100μM（+）-L-抗壞血酸鈉溶液10μL中加入190μL超純水，并準(zhǔn)備200μL的5mM（+）-L-抗壞血酸鈉溶液。
6）將4mL以上1）中制備的t-BuOH / DMSO溶液與4mL超純水混合，制備8mL的t-BuOH / DMSO /超純水。 （t-BuOH / DMSO溶液：超純水= 1：1）。
B-2. 固定配體
1）將2.5 mg疊氮化物磁珠添加到四個(gè)微管中的每一個(gè)中。在室溫下磁分離，并丟棄上清液。
2）加入500μl的t-BuOH / DMSO溶液，然后分散磁珠。在室溫下磁分離，并丟棄上清液。
3）再重復(fù)上述2）兩次，然后進(jìn)行溶劑置換。
4）從頂部溶液疊氮化物磁珠到底部抗壞血酸鈉，按如下表所示順序添加每種反應(yīng)溶液。在這種情況下，添加250μM的TBTA后，用超聲波裝置分散PuriMagTM磁珠。然后，添加剩余的解決方案（如下表）。
Concentration (um)
0
5
25
125
Azide beads (mg)
2.5
t-BuOH/DMSO (ul)
250
240
200
500uM ligands (ul)
250uM TBTA (ul)
Ultrapure water (ul)
5mM CuSO4 (ul)
5mM (＋)-Sodium L-ascorbate (ul)
Total (ul)
500
5）通過使用微型管混合器在室溫下反應(yīng)16至20小時(shí)。
6）在室溫下磁分離，并丟棄上清液。
7）加入500μl的t-BuOH / DMSO /超純水溶液，并用超聲裝置分散PuriMagTM磁珠。
8）在室溫下磁分離，并丟棄上清液。
9）再重復(fù)上述7）至8）兩次。 （用t-BuOH / DMSO /超純水溶液洗滌磁珠，共三遍。）
10）加入500μL50％MeOH，并用超聲裝置分散磁珠。
11）在室溫下磁分離，并丟棄上清液。
12）再重復(fù)上述10）至11）兩次。 （將磁珠總共洗三遍。）
13）將磁珠分散在100μL的50％MeOH中，并保存在4℃下。
（配體固定磁珠的濃度：0.5 mg / 20μL）
客戶發(fā)表相關(guān)論文：
1. Mao-Hua Gao, et al. Identification and Quantification of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine on Random DNA Sequences by a Nanoconfined Electrochemiluminescence Platform, Analytical Chemistry, 2023, 95, 25, 9598-9604, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c01252 (Azide磁珠偶聯(lián)DBCO-核酸探針)
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