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貨號
規(guī)格
MS-HYX001
1 ml
MS-HYX010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-Hydroxyl，是由超多孔聚合物網(wǎng)絡組成的磁性聚合物微載體，由羥基封端的磁珠組成。親水表面和中性官能團減少了非特異性相互作用，提高需要在珠消化應用的肽的回收率。與MagReSyn?-HYDROXYL效果等同。
MagStart微球技術的進步使生物分子可在整個微?？臻g滲透和結合，為生物分子的結合提供了極高的結合能力。MagStart微粒極高的官能團密度為生物分子提供了高密度的結合位點。MagStart的高結合載量允許減少高活性功能微粒的體積來實現(xiàn)實驗方案小型化，進而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過磁壓縮減少了洗滌和洗脫過程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Immobilization of proteins, peptides, enzymes, antibodies and other ligands
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Hydroxyl group (-OH)
Binding capacity
≥20 mg/ml (BSA)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當儲存、微粒干燥、細菌污染或離心回收可能導致容量/性能的不可逆損失。使用前應充分混勻。
2. PAC流程
Protein Aggregation Capture (PAC)
該方案用于在 1.5ml的 Eppendorf Protein LoBind? 管或 96 孔板形式中捕獲珠上蛋白質聚集，適用于任何標準磁力架。蛋白質提取可以在生物緩沖液（如Tris或PBS）中使用SDS進行，典型范圍為細胞的1%SDS到組織的4%SDS。為了最大限度地提高回收率，需要對樣品進行超聲處理和/或基于酶的核酸降解（using benzonase）。還建議在PAC之前按照標準方案進行半胱氨酸殘基的減少和烷基化（即TCEP和CAA）。
該方案針對沒有鹽酸胍或尿素作為提取劑的裂解物進行了優(yōu)化。盡管這些是相容的，但必須將樣品中的這些試劑稀釋至<3M。
由于改進了處理、快速分離和改善了磁架上的保留，該方案目前使用磁珠，特別是來自PuriMag的MagStart-Hydroxyl羥基磁珠。磁珠的使用還確保了該協(xié)議可以轉化為自動化樣品制備。
1） 建議 PAC 的蛋白質與微珠比例為 1：4（重量：重量），即對于 20μg 蛋白質，使用 100μg （5μl） 微粒。將所需的 MagStart-Hydroxyl羥基微粒（20mg/ml懸浮液）轉移到 1.5ml 低蛋白吸附的離心管或 96 孔板中。
? 注意：如有必要，可以調整蛋白質與微球的比例，特別是對于濃度低于 0.1 μg/μl的方案兼容性，您將需要大約 3 倍的微球（即蛋白質：微球比例為 1：15）以提高回收率。
2） 將試管或板放在磁力架上，讓微粒從溶液中分離（5-10 秒）。
3）取出儲存溶液（20%乙醇）并丟棄。
4）通過加入100μl的70%乙腈來平衡微粒，并通過輕輕攪拌混合（足以使顆粒保持懸浮狀態(tài)）。
5）將離心管放在磁力架上，讓微粒分離。（適用于手動、渦旋、熱混合器或智能混合器）。
6） 取出洗滌緩沖液并丟棄。
7） 重復步驟 4 和 5，總共兩次平衡。
8） 將蛋白質提取物（緩沖至 pH 值>8）添加到平衡的微粒中。
9）將乙腈加入含有微粒和生物提取物的試管中，至終濃度為70%，并用移液管混合一次，制成均勻的懸浮液。
? 大體積（例如 >500μl）的樣品可以在 1.5ml Eppendorf 管中分成較小的體積，也可以在較大的容器中進行聚集，例如 15 或 50 ml 離心管。
? 注意：我們觀察到，在較大的試管中使用乙腈進行蛋白質聚集會導致蛋白質聚集體積聚在管壁上。如果用消解溶液覆蓋管壁上的聚集，則其本身并不是問題。
10） 珠子上應在 10 分鐘內(nèi)發(fā)生沉淀，不得有任何攪拌。
11） 將試管/板放在磁架上，磁分離 5-10 秒。
12）用移液管抽吸除去上清液并丟棄。
? 注意：確保不要干擾分離的微珠-蛋白質聚集體?？梢员Ａ羯锨逡河糜赟DS-PAGE分析，以檢查任何未結合的蛋白質（檢查捕獲效率）。
13）向試管中加入 1 ml 100% 乙腈并孵育 10 秒
? 注意：在洗滌過程中，重要的是將洗滌液輕輕添加到試管中，而不會干擾微珠蛋白聚集體/沉淀。避免將洗滌緩沖液直接移液到磁分離的微珠蛋白聚集體上。洗滌次數(shù)可增加到 3 次，以提高純度。
14）向離心管加1 ml 的70% 乙醇并孵育 10 秒。
? 注意事項：70-90% 甲醇或異丙醇也可用作洗滌溶劑，以去除蛋白質樣品中的潛在污染物。如有必要，也可以重復此步驟，以提高純度。在添加酶解緩沖液之前，確保完全去除洗滌溶劑，以免干擾胰蛋白酶解。
15）從磁性架上取下試管/板，向試管中加入消化緩沖液（50mM HEPES、TEAB、碳酸氫銨或 Tris，pH 8.5）并充分混合以形成均勻的懸浮液。
? 注意：確保沿管壁的任何殘留珠子都浸沒在消化緩沖液中。粘附在管壁上的干燥珠子可以通過吸頭手動置換，直到浸沒在消化緩沖液中。
16）（可選）以 1：200（蛋白酶與蛋白質）比例加入 Lys-C，并在 37°C 下間歇混合孵育1-2 小時。
17） 以 1：50（蛋白酶與蛋白質）的比例加入胰蛋白酶，并在 37°C 下間歇混合孵育過夜（12-16 小時）。
? 注意：可以根據(jù)需要調整比率以增加或減少。通過使用較低的 LysC 和胰蛋白酶比例（例如 1：20）并在較高溫度（例如 50°C）下消化，也可以將酶解時間縮短至 1-3 小時。
18） 淬火消解，將溶液酸化至最終TFA濃度為1%。
? 注意：這可以通過添加 10% TFA 儲備溶液來實現(xiàn)，以減少對純 TFA 溶液的處理。
19）將樣品混合并放置在磁架上的試管/板中 60 秒，然后將上清液轉移到新離心管中。
20）用 50-100 μl的 1% TFA 洗滌珠子 2 分鐘，連續(xù)混合。將洗脫的蛋白轉移到新離心管。
21）混合19）和20）獲得的蛋白。
22） 以最大微量離心機速度（最大速度通常為 16,000 – 20,000 g）離心10 分鐘。
23） 將上清液和透明肽上清液轉移到新管，使用疏水性（例如 C18）或親水性（例如 HILIC）SPE脫鹽。
? 注意：在有預濃縮 LCMS 裝置的情況下，可通過在線 C18 捕集柱進行脫鹽。
24） 從疏水性SPE洗脫的肽中殘留的有機溶劑可以蒸發(fā)，并使用speedvac濃縮肽。此時殘留的 DNA 或 RNA 可以沉淀，特別是來自未經(jīng)超聲處理和/或酶促 DNA/RNA 降解的組織和某些細胞類型的樣品。
? 可選：如果您看到沉淀，請將重懸樣品以 16,000 – 20,000 g 離心 10 分鐘。
25）將上清液轉移到新管中，并通過LC/MS/MS進行分析。
參考文獻：
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