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貨號(hào)
規(guī)格
MS-HYX001
1 ml
MS-HYX010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-Hydroxyl，是由超多孔聚合物網(wǎng)絡(luò)組成的磁性聚合物微載體，由羥基封端的磁珠組成。親水表面和中性官能團(tuán)減少了非特異性相互作用，提高需要在珠消化應(yīng)用的肽的回收率。與MagReSyn?-HYDROXYL效果等同。
MagStart微球技術(shù)的進(jìn)步使生物分子可在整個(gè)微?？臻g滲透和結(jié)合，為生物分子的結(jié)合提供了極高的結(jié)合能力。MagStart微粒極高的官能團(tuán)密度為生物分子提供了高密度的結(jié)合位點(diǎn)。MagStart的高結(jié)合載量允許減少高活性功能微粒的體積來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)方案小型化，進(jìn)而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應(yīng)用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過(guò)磁壓縮減少了洗滌和洗脫過(guò)程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強(qiáng)磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Immobilization of proteins, peptides, enzymes, antibodies and other ligands
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Hydroxyl group (-OH)
Binding capacity
≥20 mg/ml (BSA)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當(dāng)儲(chǔ)存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. PAC流程
Protein Aggregation Capture (PAC)
該方案用于在 1.5ml的 Eppendorf Protein LoBind? 管或 96 孔板形式中捕獲珠上蛋白質(zhì)聚集，適用于任何標(biāo)準(zhǔn)磁力架。蛋白質(zhì)提取可以在生物緩沖液（如Tris或PBS）中使用SDS進(jìn)行，典型范圍為細(xì)胞的1%SDS到組織的4%SDS。為了最大限度地提高回收率，需要對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理和/或基于酶的核酸降解（using benzonase）。還建議在PAC之前按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行半胱氨酸殘基的減少和烷基化（即TCEP和CAA）。
該方案針對(duì)沒(méi)有鹽酸胍或尿素作為提取劑的裂解物進(jìn)行了優(yōu)化。盡管這些是相容的，但必須將樣品中的這些試劑稀釋至<3M。
由于改進(jìn)了處理、快速分離和改善了磁架上的保留，該方案目前使用磁珠，特別是來(lái)自PuriMag的MagStart-Hydroxyl羥基磁珠。磁珠的使用還確保了該協(xié)議可以轉(zhuǎn)化為自動(dòng)化樣品制備。
1） 建議 PAC 的蛋白質(zhì)與微珠比例為 1：4（重量：重量），即對(duì)于 20μg 蛋白質(zhì)，使用 100μg （5μl） 微粒。將所需的 MagStart-Hydroxyl羥基微粒（20mg/ml懸浮液）轉(zhuǎn)移到 1.5ml 低蛋白吸附的離心管或 96 孔板中。
? 注意：如有必要，可以調(diào)整蛋白質(zhì)與微球的比例，特別是對(duì)于濃度低于 0.1 μg/μl的方案兼容性，您將需要大約 3 倍的微球（即蛋白質(zhì)：微球比例為 1：15）以提高回收率。
2） 將試管或板放在磁力架上，讓微粒從溶液中分離（5-10 秒）。
3）取出儲(chǔ)存溶液（20%乙醇）并丟棄。
4）通過(guò)加入100μl的70%乙腈來(lái)平衡微粒，并通過(guò)輕輕攪拌混合（足以使顆粒保持懸浮狀態(tài)）。
5）將離心管放在磁力架上，讓微粒分離。（適用于手動(dòng)、渦旋、熱混合器或智能混合器）。
6） 取出洗滌緩沖液并丟棄。
7） 重復(fù)步驟 4 和 5，總共兩次平衡。
8） 將蛋白質(zhì)提取物（緩沖至 pH 值>8）添加到平衡的微粒中。
9）將乙腈加入含有微粒和生物提取物的試管中，至終濃度為70%，并用移液管混合一次，制成均勻的懸浮液。
? 大體積（例如 >500μl）的樣品可以在 1.5ml Eppendorf 管中分成較小的體積，也可以在較大的容器中進(jìn)行聚集，例如 15 或 50 ml 離心管。
? 注意：我們觀察到，在較大的試管中使用乙腈進(jìn)行蛋白質(zhì)聚集會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體積聚在管壁上。如果用消解溶液覆蓋管壁上的聚集，則其本身并不是問(wèn)題。
10） 珠子上應(yīng)在 10 分鐘內(nèi)發(fā)生沉淀，不得有任何攪拌。
11） 將試管/板放在磁架上，磁分離 5-10 秒。
12）用移液管抽吸除去上清液并丟棄。
? 注意：確保不要干擾分離的微珠-蛋白質(zhì)聚集體?？梢员Ａ羯锨逡河糜赟DS-PAGE分析，以檢查任何未結(jié)合的蛋白質(zhì)（檢查捕獲效率）。
13）向試管中加入 1 ml 100% 乙腈并孵育 10 秒
? 注意：在洗滌過(guò)程中，重要的是將洗滌液輕輕添加到試管中，而不會(huì)干擾微珠蛋白聚集體/沉淀。避免將洗滌緩沖液直接移液到磁分離的微珠蛋白聚集體上。洗滌次數(shù)可增加到 3 次，以提高純度。
14）向離心管加1 ml 的70% 乙醇并孵育 10 秒。
? 注意事項(xiàng)：70-90% 甲醇或異丙醇也可用作洗滌溶劑，以去除蛋白質(zhì)樣品中的潛在污染物。如有必要，也可以重復(fù)此步驟，以提高純度。在添加酶解緩沖液之前，確保完全去除洗滌溶劑，以免干擾胰蛋白酶解。
15）從磁性架上取下試管/板，向試管中加入消化緩沖液（50mM HEPES、TEAB、碳酸氫銨或 Tris，pH 8.5）并充分混合以形成均勻的懸浮液。
? 注意：確保沿管壁的任何殘留珠子都浸沒(méi)在消化緩沖液中。粘附在管壁上的干燥珠子可以通過(guò)吸頭手動(dòng)置換，直到浸沒(méi)在消化緩沖液中。
16）（可選）以 1：200（蛋白酶與蛋白質(zhì)）比例加入 Lys-C，并在 37°C 下間歇混合孵育1-2 小時(shí)。
17） 以 1：50（蛋白酶與蛋白質(zhì)）的比例加入胰蛋白酶，并在 37°C 下間歇混合孵育過(guò)夜（12-16 小時(shí)）。
? 注意：可以根據(jù)需要調(diào)整比率以增加或減少。通過(guò)使用較低的 LysC 和胰蛋白酶比例（例如 1：20）并在較高溫度（例如 50°C）下消化，也可以將酶解時(shí)間縮短至 1-3 小時(shí)。
18） 淬火消解，將溶液酸化至最終TFA濃度為1%。
? 注意：這可以通過(guò)添加 10% TFA 儲(chǔ)備溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)，以減少對(duì)純 TFA 溶液的處理。
19）將樣品混合并放置在磁架上的試管/板中 60 秒，然后將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。
20）用 50-100 μl的 1% TFA 洗滌珠子 2 分鐘，連續(xù)混合。將洗脫的蛋白轉(zhuǎn)移到新離心管。
21）混合19）和20）獲得的蛋白。
22） 以最大微量離心機(jī)速度（最大速度通常為 16,000 – 20,000 g）離心10 分鐘。
23） 將上清液和透明肽上清液轉(zhuǎn)移到新管，使用疏水性（例如 C18）或親水性（例如 HILIC）SPE脫鹽。
? 注意：在有預(yù)濃縮 LCMS 裝置的情況下，可通過(guò)在線 C18 捕集柱進(jìn)行脫鹽。
24） 從疏水性SPE洗脫的肽中殘留的有機(jī)溶劑可以蒸發(fā)，并使用speedvac濃縮肽。此時(shí)殘留的 DNA 或 RNA 可以沉淀，特別是來(lái)自未經(jīng)超聲處理和/或酶促 DNA/RNA 降解的組織和某些細(xì)胞類(lèi)型的樣品。
? 可選：如果您看到沉淀，請(qǐng)將重懸樣品以 16,000 – 20,000 g 離心 10 分鐘。
25）將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，并通過(guò)LC/MS/MS進(jìn)行分析。
參考文獻(xiàn)：
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