在生物樣本中，自發(fā)熒光是背景熒光的常見來源。 一種提高可檢測性的方法是使用時間分辨的發(fā)光試劑。 FluoBead-Eu熒光微球?qū)u3+摻入有機配位化合物中。 FluoBeads-Eu熒光微球的標(biāo)稱直徑為0.2 μm，可以不包衣或與鏈霉親和素結(jié)合使用。 鏈霉親和素蛋白標(biāo)記的珠子可用于許多基于生物素/親和素反應(yīng)的測定中的抗原和DNA靶標(biāo)的間接檢測。.
1. 產(chǎn)品特性
特 征
羧基修飾
鏈霉親和素修飾
名 稱
FluoBead-Eu-COOH
FluoBead-Eu-SA
組 成
聚苯乙烯
熒 光
銪螯合物
直 徑
0.2 μm
固含量
1 %
添加劑
0.05% NaN3
有效期
≥ 36 Mon
≥ 24 Mon
儲 存
不使用時請冷藏（2-8°C）產(chǎn)品，但不要凍結(jié)。 直立存放并保持瓶子密封。 請保存在原始的琥珀色瓶中，不要將其暴露在會使產(chǎn)品變質(zhì)的光線下。 用手或渦旋混合器輕輕顛倒混合產(chǎn)品。
注意：取用前，請先通過超聲處理，搖動或渦旋混合均勻。在超聲處理之前，將鏈霉親和素標(biāo)記的微球等分。避免珠子過度渦旋/超聲處理，因為這可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)損壞。
基于鑭系元素螯合物（例如銪）的時間分辨熒光是最敏感的熒光。將銪螯合物摻入聚苯乙烯微球中為提供更高靈敏度的測定法提供了有效的手段。 銪螯合物的檢測下限降低，并且獲得的結(jié)果不受通常導(dǎo)致熒光干擾的因素的影響。使用直徑為0.2μm的羧基修飾或鏈霉親和素包被的FluoBead-Eu熒光微球，在基于顆粒的側(cè)向流動分析中可實現(xiàn)高靈敏度。微球內(nèi)部用銪螯合物染色，具有寬的斯托克斯位移，在356 nm處激發(fā)，在613 nm處發(fā)射，并具有約0.5毫秒的超長壽命。這是大多數(shù)熒光團的10,000到100,000倍。超長壽命使銪螯合物微球可廣泛用于時間分辨熒光，包括側(cè)流分析，核酸雜交，時間分辨熒光法和免疫/組織學(xué)研究。FluoBead-Eu熒光微球的使用比常規(guī)熒光團的檢測極限降低了幾倍，因其具更高熒光強度并消除了相對短暫的基質(zhì)熒光的背景干擾。
? 羧基修飾或鏈霉親和素包被的熒光微球；
? 最大的顏色亮度和飽和度，可實現(xiàn)最佳的檢測靈敏度和可讀性；
? 封裝的染料可防止在水性介質(zhì)中浸出；
? 免疫球蛋白G有效吸附或共價偶聯(lián)以結(jié)合靶抗原；
? 銪螯合物具有較大的斯托克斯位移（激發(fā)在356 nm處激發(fā)，在613 nm處發(fā)射）。這提供了高靈敏度和低背景寬斯托克斯位移；
2. 抗體偶聯(lián)
2.1. 羧基熒光微球偶聯(lián)抗體
活化偶聯(lián)緩沖液
50 mM MES, pH 6.0.
EDC 溶液
200 mM EDC. （加 19.2 mg 的EDC 到 500 μL超純水）
Sulfo-NHS 溶液
200 mM Sulfo-NHS. （加 21.7mg的 Sulfo-NHS到 500 μL超純水）
封閉緩沖液
50 mM Tris, pH 8.0, 0.5% (w/v) casein (pH adjusted with 4 M HCl).
重要提示：請將熒光微球保持在黑暗中，即盡可能用鋁箔包裹離心管。每克微球偶聯(lián)60 mg抗體。
1. 將500μL熒光微球以1％（w / v）分裝到2 mL低蛋白結(jié)合管中。
2. 加入1 mL活化偶聯(lián)緩沖液并充分混合。
3. 以11,900×g離心7分鐘。
4. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL活化偶聯(lián)緩沖液中。上下吹打均勻混合，以免結(jié)塊可見。
5. 重復(fù)步驟3和4。
6. 最后一次洗滌后，將微球重懸于1 mL活化偶聯(lián)緩沖液中。
7. 超聲處理30秒鐘，確保微球不聚集。此時，可進行目視檢查以確保微球不聚集。
注意：單個微球在400倍放大倍數(shù)下很難看到，并且會顯示為朦朧的顆粒海洋。但是，在400倍放大倍率下很容易觀察到聚集的微球。
8. 在使用前準備新配EDC和Sulfo-NHS試劑。
9. 向1 mL洗滌過的微球（來自步驟7）中加入12μL的200 mM EDC和120μL的200 mM Sulfo-NHS。
10. 在室溫下振蕩混合30分鐘
11. 以11,900×g離心7分鐘。
12. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL活化偶聯(lián)緩沖液中–上下吹打均勻混合（將微球重懸后應(yīng)看不到團塊）。
13. 重復(fù)步驟11和12。
14. 最后一次洗滌后，將微球重懸于850μL活化偶聯(lián)緩沖液中。
15. 將微球超聲處理30秒，以確保微球是單分散的（請參閱步驟7）。
16. 在活化偶聯(lián)緩沖液中制備濃度為2 mg / mL的檢測用抗體。
17. 基于每克微球60 mg抗體的包被濃度，向850μL微球中加入150μL的2 mg / mL抗體。徹底混合。現(xiàn)總體積為1 mL。
18. 在室溫下振蕩混合2.5小時。
19. 在通風(fēng)櫥中，向微球懸浮液中添加15μL乙醇胺。渦旋并振蕩混合30分鐘以淬滅任何剩余的活性位點。
20. 以11,900×g離心7分鐘。
21. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL封閉緩沖液中–上下吹打均勻混合，以使看不到團塊。
22. 將微球超聲處理30秒，以確保微球是單分散的（請參閱步驟7）。
23. 在室溫下在振蕩混合過夜。
24. 以11,900×g離心7分鐘
25. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL封閉緩沖液中，并通過上下吸液徹底混合，以使看不到團塊。
26. 重復(fù)步驟24和25。
27. 最后一次洗滌后，將微球重懸于0.5 mL封閉緩沖液中?，F(xiàn)在，微球的含量為1％（w / v）。儲存在4℃直到可以使用。
注意：請在5天內(nèi)使用。
2.2 鏈霉親和素?zé)晒馕⑶蚺悸?lián)抗體
1. 在使用前，將磁珠渦旋20秒。
2. 將50μL（0.5mg）鏈霉親和素?zé)晒馕⑶蚣尤? mL結(jié)合緩沖液（TBS-0.05％Tween 20清潔劑）中。用結(jié)合緩沖液洗滌微球兩次。
3. 將微球重懸于450 ul結(jié)合緩沖液中。
4. 將50μl血清或細胞培養(yǎng)上清液添加到微球中。注意：根據(jù)用戶偏好修改樣品量。如果樣品體積小于500μL，則用結(jié)合緩沖液稀釋至最終體積500μL。
5. 振蕩混合30分鐘。
6. 以11,900×g離心7分鐘，并棄去上清液。用0.5ml結(jié)合緩沖液洗滌珠子兩次。
7. 最后一次洗滌后，將微球重懸于0.5 mL結(jié)合緩沖液中?，F(xiàn)在，微球的含量為1％（w / v）。儲存在4℃直到可以使用。
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